气相色谱法测定桑椹中腐霉利残留量的不确定度评定

金雅慧 宋谢清 秦丽 程静雯 李阿根*

（1.杭州市余杭区农产品质量安全检验检测站 浙江 杭州 311100；2.宁波工程学院奉化研究院；3.杭州市余杭区农业生态与植物保护服务站）

1 前言

桑椹，又称桑果、桑实、桑枣等[1]，为桑科植物桑（Morus alba L.）的干燥果实，含有丰富的维生素、氨基酸和矿物质[2]，具有增强抵抗力、降血脂、降血糖、调节免疫、防癌抗诱变、促进造血细胞生长等作用[3]。果桑菌核病是桑椹生产中的常发、重要病害，具有减产严重、连年暴发、不易防治等特点，在桑椹的主要种植区均有发生，特别是开花期遇多雨天气或在栽培设施高湿环境下，易诱发病原菌真菌菌核萌发、子囊盘抽生[4-5]，使发病率上升。果桑菌核病已成为制约果桑产业健康发展的瓶颈，目前药剂防治仍是实际生产中的主要防治措施。腐霉利（Procymidone）是一种高效低毒的内吸性杀菌剂，对葡萄孢属和核盘菌属真菌防效较好，能防治果树、蔬菜等作物的灰霉病、菌核病[6]，因其保护效果好、持效期长，在果桑菌核病防治中得到广泛应用[4-5]。

测量不确定度是对测量结果可疑程度的定量表述，用于评价检测过程中各因素对测量结果准确性的影响，为确保检测结果准确性，须进行测量不确定度的评定[7-8]。本文按照NY/T 761-2008[9]标准中第2部分的方法一进行检测，不确定度评估过程参照JJF 1135-2005化学分析测量不确定度评定[10]、JJF 1059.1-2012测量不确定度评定与表示[11]，分析、评定腐霉利检测过程中的各不确定度分量来源及影响因素，以期为相关人员测定桑椹中其他拟除虫菊酯类、有机氯类农药残留量不确定度评定提供参考。

2 材料和方法

2.1 材料和试剂

正己烷、丙酮、乙腈、氯化钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；弗罗里矽固相萃取小柱（规格1 000 mg/6 mL，上海安谱实验科技股份有限公司）；滤膜（规格0.22 μm，天津市津腾实验设备有限公司）；腐霉利标准品（1 000 μg/mL，农业部环境保护科研监测所）。

2.2 仪器和设备

食品加工器（K600，德国博朗公司）；电子天平（PL202-L，梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司）；氮吹仪（N-EVAP-12，美国Organomation公司）；漩涡混合器（MS3，德国IKA公司）；气相色谱仪（6890A，配ECD检测器，美国Agilent公司）；毛细管柱（HP-5型，30 m×0.32 mm×0.25 μm，美国Agilent公司）。

2.3 实验方法

2.3.1 标准溶液配制

准确移取0.5 mL腐霉利标准品（1 000 μg/mL），置于50 mL容量瓶中，用正己烷定容至刻度，摇匀，作为标准储备液。准确移取0.5 mL标准储备液，置于50 mL容量瓶中，用正己烷定容至刻度，摇匀，得到0.1 μg/mL标准溶液。

2.3.2 气相色谱仪参考条件

进样口温度：270℃；检测器温度：320℃；不分流进样；载气：高纯氮气（纯度99.99%），恒流模式流速1.0 mL/min；尾吹60 mL/min；柱温：70℃（保持1 min），以20℃/min升温至270℃（保持1 min），以1℃/min升温至285℃（保持5 min）；进样体积：1.0 μL。

2.3.3 样品前处理

称取桑椹样品25 g，加入乙腈50 mL；经组织匀浆机匀浆后，收集滤液；置于盛有7 g氯化钠的具塞量筒中，剧烈震荡后静置；从具塞量筒中吸取10 mL上清液，经氮吹仪吹至近干；加入2 mL正己烷，将弗罗里矽固相萃取小柱依次用5.0 mL丙酮+正已烷（10+90）、5 mL正已烷预淋、条件化；待溶剂液面到达固相萃取小柱吸附层表时，倒入上述2 mL待净化溶液；用5 mL丙酮+正已烷（10+90）淋洗固相萃取小柱，并重复1次；将盛有淋洗液的刻度离心管经氮吹仪吹至小于5 mL，用正已烷准确定容至5 mL；经旋涡混合器混匀后，过0.22 μm滤膜至样品瓶中，以供测定。

2.3.4 数学模型的建立

根据检测方法，建立桑椹样品中霉利残留量的数学模型：

式中：ω——桑椹中腐霉利的残留量（mg/kg）；Va——提取溶剂总体积 （mL）；Vb——吸取上清液体积（mL）；Vc——样品溶液定容体积（mL）；cref——标准溶液中腐霉利浓度（μg/mL）；A——样品溶液中农药腐霉利峰面积平均值；As——标准溶液中农药腐霉利峰面积平均值；m——样品的质量（g）；R——样品加标回收率（%）；fr——样品均匀性校正因子，1。

3 结果和分析

3.1 不确定度的来源分析

根据数学模型及样品测定过程进行分析，影响桑椹中腐霉利测定结果的不确定度来源主要为：检测方法总重复性；标准溶液配制过程；样品称量；样品前处理过程中的样品提取液体积、吸取上清液体积、样品溶液定容体积；样品的回收率；样品均匀性校正因子；气相色谱仪峰面积测量。

由于数学模型为乘除形式，可采用相对不确定度评定，且无需计算灵敏度系数，故桑椹样品中腐霉利残留量的相对标准不确定度合成公式为：

式中：u（rep）——峰面积A、As、移液、定容及称量等操作的重复性分量，合并而成的一个总实验的分量，利用ω重复测量数据计算的标准偏差。

3.2 不确定度分量评定

3.2.1 检测方法总重复性引入相对不确定度urel（rep）

分别称取10份样品，按“2.1”测量中的方法进行测定，结果见表1。

表1 重复测定检测结果

根据贝塞尔公式计算标准偏差：

实际测量时，一般对样品测定2次，以确定测量结果：

3.2.2 标准溶液配制过程引入相对不确定度urel（crep）

标准溶液配制测量模型为：

式中：cs——标准物质浓度（1 000 μg/mL）；V1——移液管移取的标准溶液体积（0.5 mL）；V2——定容时单标线容量瓶体积（50 mL）；V3——移液管移取的标准溶液稀释后体积（0.5 mL）；V4——再次定容时单标线容量瓶体积（50 mL）。

3.2.2.1 标准物质浓度cs引入的相对不确定度urel（cs）

使用有证标准物质，腐霉利质量浓度标准值为1 000 μg/mL，其标准物质证书提供的不确定度为3%，即±30 μg/mL，指明包含因子k=2，则由腐霉利标准品本身浓度引入相对标准不确定度为：

3.2.2.2 标准溶液配制过程中由量具、溶剂膨胀引入相对不确定度urel（Vi）（i=1～4）

JJG 196-2006常用玻璃量器检定规程[12]规定：20℃时，1 mL分度移液管的最大允许误差MPE为±0.008 mL，根据均匀分布，k=。50 mL单标线容量瓶的MPE为±0.05 mL，根据三角分布，k=。实验室温度为（20±5）℃，正己烷体积膨胀系数为1.37×10-3/℃，由此产生的体积变化根据均匀分布，k=。

3.2.2.3 标准溶液配制过程引入相对不确定度urel（crep）

3.2.3 样品称量引入相对不确定度urel（m）

查阅检定证书，样品称量所用电子天平的MPE为±0.05 g，根据均匀分布：

3.2.4 样品前处理过程中样品提取液体积、吸取上清液体积、样品溶液定容体积引入相对不确定度urel（Va）、urel（Vb）、urel（Vc）

JJG 196-2006常用玻璃量器检定规程[12]规定，20℃时，50 mL量筒的MPE为±0.25 mL；10 mL分度移液管的MPE为±0.05 mL；5 mL刻度离心管的MPE为±0.1 mL，根据按均匀分布，k=。实验室温度为（20±5）℃，乙腈、正己烷的体积膨胀系数分别为1.37×10-3/℃、1.37×10-3/℃，由此产生的体积变化根据均匀分布，k=。

3.2.5 方法回收率引入相对不确定度urel（R）

对5份阴性桑椹样品进行腐霉利加标实验（添加浓度0.010 mg/kg），回收率分别为105.3%、96.6%、94.0%、96.0%、101.6%，平均回收率为98.7%。

回收率引入的不确定度采用A类评定中的极差法进行评定：

平均回收率要进行t显著性检验：

说明回收率R不必在测量模型中采用修正测定结果，但其对不确定度的贡献须考虑。

3.2.6 样品的均匀性校正因子fr引入的相对不确定度urel（fr）

根据检测方法，平行配制3份样品，采用气相色谱仪分别进行测定，其数据为：0.906 mg/kg、0.915 mg/kg、0.912 mg/kg，据JJF 1059.1-2012测量不确定度评定与表示[11]，极差系数C为1.69。

以2次测量平均值为其测量结果：

3.2.7 色谱仪峰面积测量值引入的相对不确定度urel（A）

3.2.7.1 气相色谱仪进样体积引入的相对不确定度urel（Ve）

气相色谱仪进样器配备10 μL微量注射器进样，其使用说明书标明定量重复性为1.0%，即其重复性相对标准偏差：

3.2.7.2 气相色谱仪检测器引入的相对不确定度urel（A1）

气相色谱仪检定证书标明其定量重复性为1.3%，即其区间半宽度为0.013，根据矩形分布，k=，则可得相对标准不确定度：

3.2.7.3 色谱仪峰面积测量值引入的相对不确定度urel（A）

3.3 合成标准不确定度

由上述计算得到的各分量相对标准不确定度结果见表2，合成桑椹样品中腐霉利残留量的相对标准不确定度为：

表2 测定过程中各相对标准不确定度分量统计结果

已知2次测定值的平均值为0.353 mg/kg：

3.4 扩展不确定度和结果表示

取包含因子k=2，按95%置信概率，合成标准不确定度与包含因子相乘，计算得到测量结果的扩展不确定度为：

U=k×u（ω）＝2×0.01271＝0.02542≈0.025（mg/kg）

当测得桑椹中腐霉利残留量为ω'=0.353mg/kg时，其测量结果为：

ω=ω'±U=（0.353±0.025），k=2

4 结论

本文按照NY/T 761-2008[9]标准中第2部分的方法一，采用气相色谱法测定桑椹中腐霉利的残留量，根据数学模型及样品测定过程，分析、评定各不确定度分量，结果显示，各分量中方法回收率和标准溶液配制对总相对标准不确定度贡献率分别为37.0%、35.0%，对检测结果影响较大。在实际检测过程中，应加强实验室质量管理，通过技术培训、人员比对、制定SOP操作手册等，不断提升检测水平和操作规范性，并对仪器设备进行定期校准和维护，做好环境条件控制，以保证检测结果的准确可靠。