天参利咽颗粒质量标准研究

沈婷婷 刘瑾 徐光临 蒋洁莹

(上海中医药大学附属曙光医院，上海 200021)

天参利咽颗粒是我院根据传统经验处方研制的中药复方制剂，由南沙参、北沙参、天花粉、生白芍、百合、甘草等8味中药组成，具有清肺养阴，养胃生津，利咽喉的功效，主要用于慢性咽炎的治疗。该制剂原质量标准的检测项目较少，主要为颗粒剂的常规检查项，而对中药成分的定性定量控制较欠缺，为能更全面有效地控制制剂质量，实验选取处方中的生白芍、南沙参和甘草进行薄层鉴别，并对生白芍中的有效成分芍药苷进行含量测定的研究，试验结果表明采用的方法操作简便，灵敏度高、重复性好，可用于完善天参利咽颗粒的质量标准。

1 仪器与试药

1.1仪器 SK7200B低频率台面式超声波清洗仪(上海科导超声仪器有限公司)；Agilent1260高效液相色谱仪(美国安捷伦科技公司)；AUY220电子分析天平(日本岛津公司)；TG332A十万分之一微量分析天平(上海精密科学仪器有限公司，20g)；DHG-9140A型电加热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)；HH-ZKS4恒温数显水浴锅(上海跃进医疗硅胶器械有限公司)；硅胶G薄层板(青岛海洋化工厂，10 cm×10 cm)；定量毛细管(4 μL)。

1.2试药 天参利咽颗粒(上海中医药大学附属曙光医院制剂室，批号20190201、20190455、20190638、20190819)；天参利咽颗粒阴性样品(制剂室自制小样)；南沙参药材(上海虹桥中药饮片有限公司，批号：20190428)；甘草对照药材(中国药品生物制品检定所，批号：0904-9605)；芍药苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号110736-201539，含量96.4%)；水为纯化水，甲醇、磷酸和乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1TLC色谱鉴别

2.1.1生白芍TLC鉴别 分别称取天参利咽颗粒三批各2 g，置研钵中研细，转移至具塞锥形瓶中，加乙醇40 mL，超声处理(频率35 kHz，功率350 W)30 min，滤过，置水浴上蒸干，残渣加入1 mL乙醇使溶解，作为供试品溶液。另取芍药苷对照品，加入乙醇制备成1 mg·mL-1的对照品溶液。再取自制处方中缺白芍的阴性样品，同供试品溶液的制备方法制得阴性对照溶液。参照2020年版《中华人民共和国药典》，四部通则0502收载的薄层色谱法[1]，分别吸取上述供试品溶液和阴性对照溶液各16 μL，对照品溶液4 μL，点样于同一硅胶G薄层板上，在三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40∶5∶10∶0.2)为展开剂的展开缸预饱和15 min后，上行展开，取出，晾干，使用2%的香草醛硫酸溶液将薄层板浸润，取出，放置约3 min至斑点逐渐显色清晰。结果见图1，供试品溶液在与对照品溶液色谱相应的位置上，显相同的紫色斑点，阴性对照溶液在此位置无斑点干扰。

1-3.供试品溶液; 4.芍药苷对照品溶液;5.阴性对照溶液

2.1.2南沙参TLC鉴别 分别称取天参利咽颗粒三批各10 g，置研钵中研细，转移至圆底烧瓶中，加乙醇50 mL，经1 h加热回流后，放置冷却，滤过，滤液置水浴蒸干，得到的残渣使用1 mL的乙醇溶解，作为供试品溶液。另取南沙参药材粉碎成粉末，称取2 g，用同样的方法制得对照药材溶液。再取自制的处方中缺南沙参的阴性样品，同供试品溶液的制备方法制得阴性对照溶液，参照2020年版《中华人民共和国药典》，四部通则0502收载的薄层色谱法，分别吸取上述供试品溶液和阴性对照溶液各4 μL，对照药材溶液12 μL，点样于同一硅胶G薄层板上，在二氯甲烷-甲醇-甲酸(9∶0.5∶0.1 mL)为展开剂的展开缸预饱和15 min后，上行展开，取出后晾干，再使用2%的香草醛硫酸溶液将薄层板浸湿，放置约3 min至斑点逐渐显色清晰。结果见图2，供试品溶液在与对照药材溶液色谱相应的位置上，显相同的橙色斑点，阴性对照溶液在此位置无斑点干扰。

2.1.3甘草TLC鉴别 分别称取天参利咽颗粒三批各10 g，置研钵中研细，转移至圆底烧瓶中，加乙醇50 mL，经过1 h的加热回流，放置冷却后，滤过，滤液置水浴上蒸干，残渣加30 mL水溶解，用正丁醇振摇提取2次，每次30 mL，合并得到正丁醇液，用水洗涤2次，水液弃去，正丁醇液蒸干，在残渣中加入1 mL乙醇使溶解，作为供试品溶液。另取甘草对照药材1g，用相同的方法制得对照药材溶液。再取自制处方中缺甘草的阴性样品，同供试品溶液的制备方法制得阴性对照溶液。参照2020年版《中华人民共和国药典》，四部通则0502收载的薄层色谱法，分别吸取以上的三种溶液各4 μL，点样于同一硅胶G薄层板上，在乙酸乙酯-冰醋酸-甲酸-水(15∶1∶1∶2)为展开剂的展开缸预饱和15 min后，上行展开，取出，晾干，再使用10%的硫酸乙醇溶液将薄层板浸湿，105℃加热至斑点逐渐显色清晰。如图3所示，供试品溶液在与对照药材溶液色谱相应的位置，显相同的黄色斑点，阴性对照溶液在此位置无斑点干扰。

1-3.供试品溶液;4.南沙参对照药材溶液;5.阴性对照溶液

1-3.供试品溶液;4.甘草对照药材溶液;5.阴性对照溶液

2.2芍药苷的含量测定

2.2.1色谱条件 色谱柱为Diamonsil C18(2) 5 μm，200×4.6 mm，流动相配比为乙腈-0.1%磷酸溶液(14∶86)，设定柱温25℃，流速1.0 mL·min-1，检测波长230 nm，进样量为10 μL，理论塔板数按芍药苷峰计算不低于2000。

2.2.2各溶液的制备 ① 对照品溶液的制备：取芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，制成浓度为120 μg·mL-1的溶液，备用。

② 供试品溶液的制备：取天参利咽颗粒适量，研成细粉后取1 g，精密称定，置于50 mL容量瓶中，加入50%的乙醇35 mL，超声处理30 min，冷却后再加入50%的乙醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，备用。

③ 阴性对照溶液的制备：取自制处方中缺白芍的阴性样品，同供试品溶液的制备方法制得阴性对照溶液，备用。

2.2.3专属性实验[2]取以上对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各10 μL，照“2.2.1”项建立的色谱条件分别进样检测，观察结果。结果供试品溶液中被测组分的保留时间与芍药苷对照品的保留时间一致，且与相邻峰分离度好，阴性对照溶液在相应的保留时间内无吸收峰，对被测组分未产生干扰，所建立的方法专属性强。(图4-a、图4-b、图4-c)

2.2.4标准曲线和线性关系考察 取芍药苷对照品适量，用微量分析天平精密称定，加甲醇溶解，制成246 μg·mL-1的浓溶液，分别精密吸取该浓溶液1、3、5、6 mL，分别置于10 mL容量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，摇匀，得到芍药苷对照品溶液的浓度分别为24.6，73.8，123.0，147.6 μg·mL-1，和浓溶液一起按照“2.2.1”项下色谱条件依次进样10 μL，以峰面积积分值(Y)为纵坐标，芍药苷对照品溶液浓度(X，μg·mL-1)为横坐标，绘制标准曲线，获得回归方程为：Y=13.521X+7.4313，r=0.9999，如图5所示：结果表明，芍药苷在24.6～246.0 μg·mL-1范围内线性关系良好。

2.2.5精密度实验 取123.0 μg·mL-1的芍药苷对照品溶液，按“2.2.1”项下的色谱条件连续进样6次，记录峰面积，计算得芍药苷峰面积的RSD值为1.86%，表明所使用的仪器具有较好的精密度。

2.2.6稳定性实验[3-4]取同一份供试品溶液，分别于常温下放置0、2、4、8、12 h后取样，按“2.2.1”项下色谱条件依次进样，记录峰面积，计算得芍药苷峰面积的RSD值为1.79%.结果表明样品常温放置，12 h之内，较为稳定。

图4 HPLC色谱图

2.2.7重复性实验[5]取同一批样品(批号20190638)，照“2.2.2”②项下供试品溶液的制备方法平行制备6份，按“2.2.1”项下色谱条件分别进样，记录峰面积，计算每份样品的芍药苷含量，得芍药苷的平均含量为4.45 mg·g-1，RSD为2.02%，表明该方法重复性良好。

2.2.8加样回收实验[6]取已知芍药苷含量为4.45 mg·g-1的同一批样品(批号20190638)6份，精密称定，分别精密加入芍药苷对照品适量，照“2.2.2”②项下方法处理后，按“2.2.1”项色谱条件分别进样，记录峰面积并计算，结果得芍药苷的平均回收率为100.05%，RSD为2.03%(见表1)。

表1 芍药苷加样回收率实验结果

2.2.9样品含量测定 取不同批次的4批样品，照“2.2.2”②项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项色谱条件进样，记录峰面积，计算芍药苷的含量。(见表2)

表2 4批样品芍药苷含量测定结果

3 讨论

天参利咽颗粒源于已故全国名老中医张赞臣的“养阴利咽汤”经验方，多年的临床实践证明，天参利咽颗粒对于慢性咽炎具有很好的疗效[7]。方中南沙参为君药，具有滋养肺胃,养阴生津的功效。甘草具有泻火解毒利咽的功效，为方中的臣药。白芍生用是此方较于经验方“养阴利咽汤”一大改进的地方，其味苦酸与方中其它甘润之品相配，可增加敛阴生津之力[8]。根据在处方中的功效及用量，选取此三味代表性的中药进行薄层色谱鉴别和含量测定的研究。

3.1薄层鉴别 实验中，曾尝试分别采用二氯甲烷和正己烷超声处理样品，欲提取制剂中南沙参的化学成分蒲公英萜酮作定性鉴别项，结果斑点均未能在薄层板呈现，分析原因可能为该成分在制剂生产过程中已被破坏，于是参考马燕等[9]对南沙参薄层鉴别的研究资料，以南沙参对照药材为参照，改变供试品的提取方式和展开剂，结果较为满意。在显色时，由于2%香草醛硫酸溶液粘度较大，不易喷雾，故改为浸渍显色，不仅可以使薄层板各部位均匀地接触显色剂，也减少了环境污染。浸板时间不宜长，要顷刻取出，放置片刻即可显现斑点，加热易使薄层板碳化[10]，斑点扩散模糊，后面生白芍的薄层显色亦是如此。另外对药典收载的甘草薄层鉴别法进行借鉴和调整[11-12]，为避免使用有毒易燃的试剂，供试品处理则去掉乙醚加热回流这一步。文中所建立TLC定性鉴别方法操作简便，特征斑点明显，且Rf值适中，阴性对照均无干扰。

3.2方法学考察 生白芍所占处方比例量大，且芍药苷含量较高，测定方法成熟[13-14]，灵敏度高，可作为该制剂含量测定的指标成分，流动相及检测波长经查阅药典及相关文献[15-16]优选确定，建立该制剂的高效液相含量测定方法，其仪器的精密度、操作重复性、样品的稳定性均符合要求，芍药苷主峰分离度较好。在确定含量测定项中的供试样品溶液配制方法前，分别使用50%乙醇和 70%乙醇作为提取溶剂进行比较，结果 50%乙醇提取效率稍高，同时又对加热回流和超声两种提取方式进行比较，测定结果差异不大，综合考虑超声提取操作简便，不容易破坏有效成分，故选择此制备方法。本研究中，4批天参利咽颗粒的芍药苷含量差异明显，分析原因可能为所用的中药材质量差异或制剂过程中的人为操作因素所致[17]，今后将更加规范操作,从固定的供货商处采购来源、炮制方式相同的饮片进行投料，并通过制订含量限度控制制剂的质量，由于4批样品芍药苷的平均含量为4.13 mg·g-1，其均值的80%为3.304 mg·g-1，故拟定天参利咽颗粒的含量限度为每1 g含生白芍(以芍药苷C23H28O11计)不得少于3.3 mg[18-20]。

由于中药复方制剂作用机制复杂，受时间和条件的限制，本文只对以上几味中药进行了相关的研究，今后还将继续进一步研究。考虑到该制剂的生产工艺为中药饮片煎煮浓缩而成，并无生药粉直接投料使用，显微鉴别中药成分较为困难，所以后续的研究仍将以增加定性鉴别项目和定量测定项目为方向，使该制剂的质量标准的制订能够更加完善使其质量得到全面有效的控制。