miR- 19b- 3p 在病毒性心肌炎心脏损伤中的作用及机制

陈加辉 何建 戴璐 周瑞

病毒性心肌炎（viral myocarditis，VM）是一种炎症性疾病，而柯萨奇病毒B3（Coxsackie virus B3，CVB3）被认为是VM 最常见的病原体[1-3]。巨噬细胞作为主要的炎性细胞亚群，在CVB3 感染3 d 后即可在心脏组织富集。根据心脏微环境的不同，巨噬细胞可以极化成经典激活的M1 表型或交替激活的M2 表型。M1 型巨噬细胞由脂多糖和干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）诱导产生，通过产生炎性细胞因子来促进心肌炎症反应的发展[4]。相反的，由白细胞介素（interleukin，IL）-4 或IL-13 诱导的M2 型巨噬细胞可以分泌与组织修复相关的抗炎细胞因子。研究表明，miR-19b-3p 可以通过调节巨噬细胞极化、抑制经典的炎症途径和增强其他抗炎反应来减轻饮食诱导的脂肪组织炎症反应[5]。因此，本研究利用CVB3 感染的HeLa 细胞注射法构建VM 小鼠模型，就miR-19b-3p 在VM 心脏损伤中的作用及机制作一探讨，现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 实验动物 6~7 周龄雄性BALB/c 小鼠40 只，体重（22.7±2.94）g，购自上海杰思捷实验动物公司。所有小鼠饲养在无特定病原体的环境中，维持12 h 的光/暗周期。所有实验步骤符合动物伦理学要求。

1.2 主要试剂和仪器 pLL3.7（批号：VT2204）购自重庆优宝生物技术股份有限公司，TBST 缓冲液（批号：T196393）、磷酸盐缓冲液（批号：P301981）均购自上海阿拉丁试剂公司，辣根过氧化物酶标记免疫球蛋白结合物-兔抗鼠IgG 结合物（批号：ab233006）均购自英国Abcam 公司，Trizol 试剂（批号：A33253）均购自美国赛默飞公司，RPMI 1640 培养基（批号：R8758）购自美国Sigma-Aldrich 公司。低速离心机（型号：TDZ4B-WS）购自上海贝恩生物科技有限公司，CO2培养箱（型号：BC-J160S）、超净工作台（型号：SW-CJ-2FD）均购自上海博讯有限公司，实时荧光定量逆转录- 聚合酶链反应（quantitative-real time polymerase chain reaction，qRT-PCR）仪（型号：Realplex）均购自德国Eppendorf 公司，倒置显微镜（型号：GX41）购自日本Olympus 公司，电泳仪（型号：EPS300）购自上海天能科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 动物分组与处理 40 只小鼠按随机数字表法分为4 组，即CVB3 组、CVB3+miR-19b-3p 组、CVB3+NC 组、对照组，每组10 只。前3 组小鼠腹腔注射含6×103个CVB3 感染的HeLa 细胞，构建VM小鼠模型[6]；对照组仅腹腔注射磷酸盐缓冲液。建模后第1、3 天，CVB3+miR-19b-3p 组按50 μg/kg 腹腔注射慢病毒载体pLL3.7-miR-19b-3p，CVB3+NC 组给予等剂量空载体pLL3.7。建模后第7 天处死小鼠，取心肌组织进行病理学观察和心肌炎相关指标检测。

1.3.2 细胞分离获取 取小鼠心脏组织并切成1 mm3的小块，用0.1%Ⅱ型胶原酶、0.01%透明质酸酶消化2 h，采用密度梯度分离法从单个细胞中分离炎性细胞；采用FITC 标记的抗F4/80 单克隆抗体染色，通过流式细胞仪分选法分离巨噬细胞，即心脏浸润巨噬细胞，以待后续M1 及M2 标志物mRNA 表达水平检测。

1.3.3 心肌组织病理学观察 采用HE 染色法。取小鼠心肌组织进行甲醛固定、石蜡包埋、切片、HE染色。在倒置显微镜下观察，计算心肌炎症面积百分比，即炎症组织占整个心肌组织切片的面积百分比。

1.3.4 心肌炎相关指标检测 采用酶联免疫吸附试验法。取心脏组织剪碎，10 000~15 000 r/min 离心14 min，加入0.9%氯化钠溶液制成10%心肌组织匀浆，取0.5 mL 上清液备用。使用酶联免疫吸附试验试剂盒检测上清液中肌酸激酶同工酶（creatine kinase-MB，CK-MB）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）、IFN-γ、IL-6、IL-10 水平。

1.3.5 M1 及M2 标志物mRNA 表达水平检测 采用qRT-PCR 法。采用Trizol 试剂提取心脏浸润巨噬细胞的总RNA，使用miRcute miRNA First-Strand cDNA 合成试剂盒进行逆转录，使用TaqMan microRNA 进行分析。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶为内参，采用2-ΔΔCt法计算M1 标志物[包括诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）]、M2 标志物（包括精氨酸酶-1、FIZZ-1）mRNA 表达水平。

1.4 统计学处理 采用GraphPad Prism 5.0 统计软件。计量资料多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4 组小鼠心肌组织病理学改变比较 与对照组比 较，CVB3 组、CVB3+miR-19b-3p 组、CVB3+NC组小鼠心肌炎症面积百分比均明显升高（均P＜0.05）；与CVB3 组、CVB3+NC 组比较，CVB3+miR-19b-3p 组小鼠心肌炎症面积百分比均明显降低（均P＜0.05），见图1。

2.2 4 组小鼠心肌炎相关指标比较 与对照组比较，CVB3 组、CVB3+miR-19b-3p 组、CVB3+NC 组小鼠CK-MB、LDH、AST、IFN-γ、IL-6 水平均明显升高（均P＜0.05），IL-10 水平均明显降低（均P＜0.05）；与CVB3 组、CVB3+NC 组比较，CVB3+miR-19b-3p 组小鼠CK-MB、LDH、AST、IFN-γ、IL-6 水平均明显降低（均P＜0.05），IL-10 水平均明显升高（均P＜0.05），见图2。

2.3 4 组小鼠心脏浸润巨噬细胞M1 及M2 标志物mRNA 表达水平比较 与对照组比较，CVB3 组、CVB3+NC 组小鼠心脏浸润巨噬细胞M1 标志物mRNA 表达水平均明显升高（均P＜0.05），CVB3+miR-19b-3p 组M2 标志物mRNA 表达水平均明显升高（均P＜0.05）；与CVB3 组、CVB3+NC 组比较，CVB3+miR-19b-3p 组M1 标志物mRNA 表达水平均明显降低（均P＜0.05），而M2 标志物mRNA 表达水平均明显升高（均P＜0.05），见图3。

3 讨论

目前关于VM 的发病机制尚未完全清楚。相关文献报道，miR-19b-3p 与多种人类癌症、代谢紊乱、心血管疾病及炎症性疾病有关[7]。亦有研究表明，miR-19b-3p 具有抗炎、保护心脏等作用[8]。因此，本研究采用CVB3 感染的HeLa 细胞注射法建立VM小鼠模型，就miR-19b-3p 在VM 心脏损伤中的作用及机制作一探讨。

图1 4 组小鼠心肌组织病理学改变比较（a：HE 染色所见，×50；b：心肌炎症面积百分比，与对照组比较，*P＜0.05，与CVB3+miR-19b-3p 组比较，△P＜0.05）

图2 4 组小鼠心肌炎相关指标比较

图3 4 组小鼠心脏浸润巨噬细胞M1 及M2 标志物mRNA 表达水平比较（a：M1 标志物比较；b：M2 标志物比较）

本研究结果显示，过表达miR-19b-3p 可以保护小鼠免受CVB3 诱导的VM 影响，主要表现为小鼠心肌炎症反应减轻，CK-MB、LDH、AST、IFN-γ、IL-6 水平均明显降低，IL-10 水平明显升高。以上结果提示，miR-19b-3p 能明显减轻CVB3 诱导的心肌炎。研究表明，免疫反应在VM 的心肌损伤过程中发挥着重要作用[9-10]。心肌巨噬细胞作为最早浸润的炎性细胞，参与VM 的免疫反应，而不同的巨噬细胞极化在炎症反应中发挥不同的作用。据文献报道，M1 型巨噬细胞可加重心肌炎症反应，而M2 型巨噬细胞则减轻心肌炎症反应[11]。本研究分离不同处理组小鼠的心脏浸润巨噬细胞，结果发现与CVB3 组、CVB3+NC 组比较，CVB3+miR-19b-3p组M1 标志物mRNA 表达水平均明显降低，而M2标志物mRNA 表达水平均明显升高，这提示miR-19b-3p 对巨噬细胞极化具有调节作用，miR-19b-3p 过表达能促进M2 型巨噬细胞极化并抑制M1 型巨噬细胞极化。相关文献报道，沉默miR-155 可通过促进M2 型巨噬细胞极化来减轻VM 的心脏损伤和功能障碍[12-13]。因此，笔者推测miR-19b-3p 过表达可通过抑制M1 型巨噬细胞极化、促进M2 型巨噬细胞极化对CVB3 诱导的VM起心脏保护作用。

综上所述，miR-19b-3p 对CVB3 诱导的VM 具有心脏保护作用，其机制可能与miR-19b-3p 调节巨噬细胞极化有关。