枸骨法尼基焦磷酸合酶IcFPS2基因克隆与原核表达分析

涂 逸，曾 慧，张威威，许 锋，廖咏玲，叶家保

枸骨法尼基焦磷酸合酶基因克隆与原核表达分析

涂 逸，曾 慧，张威威*，许 锋，廖咏玲，叶家保

长江大学园艺园林学院，湖北 荆州 434025

克隆枸骨三萜皂苷生物合成途径中关键酶法尼基焦磷酸合酶（farnesyl diphosphate synthase，）基因，对其进行组织特异性表达分析，构建原核表达载体并进行重组蛋白诱导表达，探究其参与调控三萜皂苷生物合成的功能。结合枸骨转录组数据设计特异性引物，采用PCR技术从枸骨叶中扩增得到了基因的cDNA序列，对其进行生物信息学分析；通过实时荧光定量进一步分析其组织表达特异性，构建原核表达载体pET32a-，并转化至大肠杆菌BL21（DE3）pLysS感受态细胞，经异丙基-β--硫代半乳糖苷（IPTG）诱导重组蛋白的表达。基因长1259 bp，开放阅读框为1050 bp，编码350个氨基酸，其蛋白质相对分子质量和等电点分别为40 200、5.54。氨基酸序列比对分析表明枸骨与栀子、杜仲、甘草、绞股蓝、竹节参的FPS氨基酸序列具有较高的同源性。系统进化树分析显示，蛋白与西洋参、人参、竹节参FPS蛋白聚为一支，表明枸骨FPS蛋白可能与双子叶植物五加科FPS蛋白在功能上较为接近。实时荧光定量PCR分析表明，基因在根中的表达量最高，其次是叶，而后是雄花和茎，该基因在雌花中表达水平最低。原核表达分析结果显示，构建的pET-32a载体能在大肠杆菌BL21（DE3）中成功表达，SDS-PAGE结果显示，诱导的重组表达蛋白相对分子质量在45 000左右，与预测的IcFPS2蛋白大小基本一致。通过对基因的全长cDNA 克隆与生物信息学分析、组织表达特异性分析和原核表达载体的构建，为后续进一步研究法尼基焦磷酸合酶基因在枸骨三萜皂苷生物合成途径的功能供科学依据。

枸骨；法尼基焦磷酸合酶；克隆；表达分析；原核表达

枸骨L.为冬青科（Aquifoliaceae）冬青属常绿灌木或小乔木，在我国长江中下游地区各省均有栽培。枸骨是一味传统的药食同源植物，其主要药用部位是枸骨的干燥叶，常用于治疗风湿痹痛、肺痨咳嗽、劳伤失血等症状[1]，同时也是“苦丁茶”的主要原料之一[2]。三萜皂苷（triterpenoids saponins）是枸骨的主要活性成分[3]，现代药理学研究表明枸骨三萜皂苷具有调血脂、抗氧化、抗炎、抗肿瘤等作用[4-8]。三萜皂苷还广泛分布于人参[9]、金铁锁[10]、三七[11]、无患子[12]等药用植物中。近年来随着枸骨药用价值不断被挖掘，医药等行业对枸骨的需求日益增加。因此，研究枸骨三萜皂苷的分子机制及提高枸骨药材中三萜皂苷的含量具有重要意义。

枸骨三萜皂苷主要是通过甲羟戊酸途径合成而来的，法尼基焦磷酸合酶（farnesyl diphosphate synthase，）是该生物合成途径中的一个关键酶。是甲羟戊酸途径中的主链延伸酶，催化二甲基烯丙基二磷酸（dimethylallyl pyrophosphate，DMAPP）和香叶基二磷酸（geranyl diphosphate，GP）与异戊烯基二磷酸的连续缩合生成法尼基二磷酸（farnesyl diphosphate，FPP）；也是第一个承担流向各个化合物分支点反应底物的酶[13]。因此，FPS蛋白的活性和功能会影响下游萜类物质的合成[13]。目前，基因已在广藿香[14]、赤芝[15]、独行菜[16]、千里光[17]等多种植物中被成功克隆与鉴定。本研究从枸骨叶中扩增得到基因序列，并进行生物信息学分析，组织表达模式分析，以及原核表达研究，以期为进一步弄清枸骨基因的功能，解析三萜皂苷合成通路奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料

枸骨的根、茎、叶、雄花和雌花组织采摘于长江大学校园，液氮速冻后转至−80 ℃冰箱保存，用于后续RNA提取和基因表达分析。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取和cDNA合成 从−80 ℃取出冻存的枸骨各组织材料，使用液氮研磨至粉末，依据TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit提取试剂盒说明提取各组织的总RNA，用1%琼脂糖凝胶电泳和和核酸浓度检测仪检测RNA的质量、完整性以及浓度。按照PrimeScript™ 1st Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒说明进行cDNA第一链反转录。

1.2.2 枸骨基因的克隆 根据枸骨转录组数据[18-20]挖掘出2条法尼基焦磷酸合酶基因序列，分别为、，本研究对其中的一个展开试验。利用Primer5软件设计特异性克隆引物（表1），以枸骨cDNA为模板进行PCR反应。反应体系共50 μL，包括2×Rapid Taq Master Mix 25 μL，上下游引物各2 μL，cDNA 1 μL及ddH2O 20 μL。PCR反应条件：95 ℃、3 min，95 ℃、15 s，58 ℃、15 s，72 ℃、30 s，共35个循环，最后72 ℃延伸5 min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，按照FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit试剂盒纯化回收扩增产物，将回收产物连接至pMD18-T载体，转化大肠杆菌DH5α感受态，37 ℃ 200 r/min振荡培养1 h，涂布于含50 μg/mL Amp的LB培养平板上，37 ℃倒置培养过夜。挑取单菌落活化并进行菌液PCR验证，将阳性的单克隆菌液送至上海生物工程公司测序。

1.2.3 枸骨基因的生物信息学分析 利用NCBI-BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BlAST/）在线工具进行序列同源比对，DNAMAN软件完成蛋白质序列翻译，采用在线工具SPOMA进行蛋白质二级结构预测，使用ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）进行蛋白理化性质分析。利用Vector NTI Suite V11.5软件对多种植物的FPS蛋白进行氨基酸序列比对分析，利用Clustal X 2. 0和MEGA 6.0软件，采用邻接法（NJ）构建系统进化树，使用Bootstrap对系统树可信性进行检验，重复1000次。

1.2.4基因的组织特异性表达分析 根据TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit试剂盒和PrimeScript™1st Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒说明书，分别提取枸骨新鲜组织根、茎、叶、雄花和雌花的总RNA并反转录为cDNA。根据基因cDNA序列设计定量引物，qRT-PCR内参基因选用的是（表1）。反应总体系为20 μL，包括2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，正反引物各0.4 μL，模板cDNA 2 μL，ddH2O 7.2 μL。反应程序为95 ℃、30 s，95 ℃、10 s，60 ℃、10 s，共35个循环，溶解曲线为95 ℃、15s，60 ℃、60 s，95 ℃、15 s。qRT-PCR实验分别设置一个阴性对照，基因相对表达量使用2-ΔΔCt方法[18]计算，进行3次生物学重复与3次技术重复。

1.2.5 原核表达分析 为了鉴定基因的生物学功能，利用pET32a载体，进行了该基因的原核表达分析。实验选择I和Ⅲ作为酶切位点，设计含酶切位点的扩增引物（表1）。以枸骨叶cDNA为模板扩增获得基因序列，进行胶回收纯化，采用北京全式金生物质粒提取试剂盒提取pET32a质粒。采用双酶切法，分别对基因和pET32a质粒进行酶切，酶切产物纯化后使用T4连接酶连接。用热激法将重组质粒载体pET32a-转入DH5α大肠杆菌感受态，活化后涂布在含有Amp的LB平板上，37 ℃过夜培养，菌液PCR筛选阳性单克隆，送至上海生物工程公司测序。将构建成功的重组质粒pET32a-转化大肠杆菌BL21（DE3）pLysS感受态，经菌落培养、PCR鉴定后挑选阳性单菌落到含Amp的LB液体培养基中活化12 h。取活化好的菌液按1∶50的稀释比例加至含有抗生素的50 mL LB培养基中，37 ℃恒温摇床200 r/min培养到600值0.6～1.0，加入不同浓度的IPTG，28 ℃诱导蛋白表达0、4、8 h，以转化空载体pET32a的表达作为对照。收集诱导菌液，在4 ℃以5000 r/min冷冻离心5 min得到菌体沉淀，使用200 μL蛋白提取缓冲液重悬菌体，低温下超声破碎菌体30 min，12 000 r/min冷冻离心10 min得到样品上清蛋白，取10 μL进行SDS-PAGE电泳检测。

表1 引物序列信息

2 结果与分析

2.1 IcFPS2基因cDNA克隆与序列分析

以反转录的cDNA为模板，利用PCR和TA克隆得到基因的cDNA序列（图1），经测序和在线工具NCBI-Blast比对，此cDNA序列与其他物种的FPS基因序列具有较高的一致性，说明克隆获得的cDNA序列为枸骨的基因，命名为。该cDNA长为1259 bp，开放阅读框（open reading frame，ORF）为1050 bp，编码350个氨基酸（图2）。

图1 IcFPS2基因扩增

图2 IcFPS2基因cDNA序列和推测的氨基酸序列

2.2 枸骨IcFPS2蛋白的生物信息学分析

2.2.1 枸骨IcFPS2蛋白的理化性质分析 分析发现，IcFPS2蛋白的相对分子质量为40 200，理论等电点为5.54；SOPMA分析IcFPS2蛋白二级结构显示α螺旋、无规则卷曲和β转角占比分别为63.04%、27.51%、2.87%；在线工具BlASTP（NCBI）和Align X（Vetctor NTI 11.5）软件分析显示，蛋白属于类异戊二烯合成酶（isoprenoid_biosyn_C1）超家族的成员。

2.2.2 枸骨IcFPS2蛋白质的同源比对 利用Vetctor NTI 11.5软件对枸骨2个基因的氨基酸序列进行比对，同源性为83.7%，属于同源蛋白。且将与及其他物种基因编码的氨基酸序列进行序列比对，结果显示与其他植物基因编码的蛋白序列高度同源（图3），其中与栀子（AYC62332.1）的FPS蛋白质一致性最高，高达90.26%，与杜仲（APG79413）、橡胶树（ALR72606）、米团花（ALT07952）、甘草（ADE18770）、胡椒薄荷（AAK63847）、假马齿苋（ADV03080）、绞股蓝（AII72208）和竹节参（AKN52395）等FPS蛋白质的一致性均在80%以上，分别为88.83%、87.98%、87.11%、87.10%、87.9%、86.82%、86.51%、86.22%。

2.2.3 枸骨IcFPS2蛋白质的系统进化分析 为了研究枸骨IcFPS2蛋白质与及其他植物FPS蛋白质的亲缘关系，基于的氨基酸序列，利用BlastP在线工具，检索了人参C. A. Meyer、西洋参L.、竹节参s (T. Nees) C. A. Meyer、一串红Ker-Gawler、栀子Ellis等11种植物的FPS蛋白序列，采用ClustaIX 2.0和MEGA 6.0软件构建了FPS蛋白序列系统进化树（图4）。进化树结果显示，IcFPS1蛋白和IcFPS2蛋白都与人参、西洋参和竹节参的蛋白聚类在同一分支上，表明枸骨FPS蛋白可能与双子叶植物五加科FPS蛋白在功能上较为接近。在枸骨中，推测IcFPS1、IcFPS2可能协同调控枸骨萜类化合物的合成。

一致氨基酸用白色前景和黑色背景表示；保守氨基酸用白色前景和灰色背景表示；非相似氨基酸用黑色前景和白色背景表示；红色框表示显著相似性的7个区域；黄色框表示高度保守区域

图4 不同物种FPS基因的系统进化树

不同字母表示差异显著，P＜0.05

2.3 IcFPS2基因表达水平分析

为了探究基因的生物学功能，通过qRT-PCR检测了在枸骨根、茎、叶、雄花和雌花中的表达模式。结果如图5显示，基因在枸骨各个器官中均有表达；其中，在根中的相对表达量最高，其次叶，而后是雄花、茎，在雌花中的表达量最低。该结果表明基因在枸骨的表达具有组织器官特异性。有研究表明，植物基因表达具有组织特异性，并且伴随着类异戊二烯衍生物含量增加而增加[19]。前期研究发现，枸骨齐墩果酸在根中含量最高，熊果酸在叶片中含量最高；三萜化合物总含量在根中最高，其次是叶和果实[20]。本研究中基因也在根中的相对表达量最高，与三萜皂苷组织分布呈现一致性，因此，推测可能也与枸骨三萜皂苷的生物合成量密切相关。

2.4 IcFPS2基因的原核表达分析

本研究利用酶切位点I和III，通过双酶切法构建了pET32a-原核表达载体。挑选转入大肠杆菌的克隆子，PCR扩增得到了大小约1100 bp的条带（图6），与目的片段大小一致；进一步测序验证条带正确，表明原核载体IcFPS2-pET32a构建成功。将构建成功的重组pET32a-原核表达载体导入大肠杆菌BL21（DE3）pLysS中，加入不同浓度的IPTG，在28 ℃条件下诱导蛋白表达，0、4、8 h后取样处理后进行SDS-PAGE电泳检测。结果如图7所示，以大肠杆菌BL21（DE3）pLysS为宿主菌，1 mmol/L IPTG，28 ℃、200 r/min振摇诱导22 h为条件，在45 000附近位置出现了特异蛋白带，特异蛋白带大小符合预期。未经诱导的含有重组质粒pET32a-的菌株不表达该蛋白。说明原核表达载体pET32a-构建成功，并通过IPTG诱导成功表达。且1 mmol/L IPTG条件下的pET32a-重组质粒成功在4 h和8 h时间内诱导出目的蛋白条带，但未经诱导的重组质粒不表达该蛋白。

图6 pET32a-IcFPS2重组质粒阳性克隆检测

M-Marker 1-空载体pET32a 2～3-1 mmol/L IPTG诱导空载pET32a表达0、4 h 4-未经诱导的重组质粒pET32a-IcFPS2 5～7-1 mmol/L IPTG诱导重组质粒pET32a-IcFPS2 0、4、8 h。

3 讨论

三萜皂苷广泛分布在植物界中，在枸骨、人参、三七、黄芪、绞股蓝等植物中的含量较高。枸骨三萜皂苷不仅参与植物病原体、病害的防御、生长发育和感觉调控作用外，还具有抗炎、抗肿瘤、抗菌等多种药理功效[21]。随着枸骨药用价值不断被挖掘，枸骨三萜皂苷生物合成途径也受到了越来越多学者的关注。为了进一步探究枸骨三萜皂苷生物合成途径中关键酶和目标基因的分子调控机制，本研究基于枸骨转录组数据，通过PCR技术成功的从枸骨叶中扩增得到了1个基因的全长cDNA序列。同源氨基酸序列比对表明，IcFPS2蛋白与IcFPS1蛋白的一致性为83.7%，且IcFPS2的蛋白与栀子、杜仲、橡胶树、米团花、绞股蓝、甘草、竹节参等植物的FPS蛋白高度同源。还有来自原核和真核的所有FPS的显著相似性的7个区域I～VII几乎相同[22]，其中II和VI区域富含高度保守的天冬氨酸序列，分别为DDXX（XX）D（D为天冬氨酸，X为任意氨基酸），被称为FARM；另一个是DDXXD，被称为SARM[23]。此外，系统进化树分析显示IcFPS1、IcFPS2蛋白与五加科FPS蛋白在进化关系上较近，推测、可能协同调控枸骨萜类化合物的合成。

三萜皂苷的分布具有组织和器官特异性，如人参C. A. Meyer、桔梗(Jacq.) A. DC.灵芝(Curtis) P. Karst、三七的根，麦蓝菜(Miller) Rauschert）的种子，罗汉果(Swingle) C. Jeffrey ex A. M. Lu et Z. Y. Zhang的果实和积雪草的茎、叶，白桦suk.树皮和树叶等部位均积累着丰富的三萜皂苷[24]。本研究实时荧光定量结果显示基因在枸骨的五个组织中的表达量存在差异性，其中在根中的表达量最高。目前已在多种植物中进行了基因的分离与功能验证，如千里光基因在花、叶、茎和根中均有表达，在根和叶中的表达量最高[17]；金铁锁基因在根、叶、茎中均有差异表达，且在根中的表达量最高[25]；枸骨在根中的基因表达量最高，叶中表达量次之，雄花中较低，在茎和雌花中的表达量最低[26]；橡胶草在橡胶草的叶片中表达量最高，根、叶柄、种子次之，花中表达量最低[27]；金线莲中的在根和茎中的相对表达量高，叶次之[28]；杜仲在叶片和果实中广泛表达[29]。这与本研究的基因表达结果相似。而人参基因的表达水平随着生长周期的增加呈明显递减的趋势，其中在展叶期的表达量最高，而根中的表达量趋于0[30]；刺五加在幼茎中的表达量最高，叶柄和根次之，叶片中的表达量最低[31]。这些研究表明基因的转录水平在不同组织中表达可能与次生代谢产物的合成积累部位有关，而在不同的植物中又存在一定的个体差异性。法尼基焦磷酸合酶是甲羟戊酸途径中偏上游的第一个分支点的限速酶，在三萜皂苷合成途径中起着至关重要的作用。采用过表达方式提高三七的转录水平，有利于促进三七皂苷的积累[32]；刘美佳等[33]研究发现转基因珠子参比野生型珠子参含有更高的皂苷含量。因此，通过调控基因的表达水平将有助于提高枸骨三萜皂苷的含量。

为更进一步研究基因在枸骨中的功能，构建了pET32a-载体，并且在大肠杆菌中异源表达，获得分子质量约为45 000的重组蛋白。

原核生物中表达载体有多种，其中pET是目前使用最为广泛且很便捷的载体之一[34]；同时，BL21（DE3）是一种高效表达且成本较低的表达系统[35]。与昌燕李[36]研究木薯的结论一致，本研究所选用的pET32a载体和大肠杆菌BL21（DE3）可以高效、大量地诱导IcFPS2蛋白表达。周晨等[37]利用大肠杆菌构建泽泻基因的原核表达载体，为后期提高泽泻中原萜烷型四环三萜含量提供了科学依据；梁良等[38]成功获得白木香pET28a重组蛋白，为揭示沉香倍半萜形成的分子机制奠定了基础；李铁铮等[39]首次在大肠杆菌中表达了白木香的AsERF1蛋白，后期希望能够在蛋白水平上研究白木香中的生物学功能奠定了分子基础。还有单婷玉等[40]利用大肠杆菌构建山楂鲨烯合酶、基因的原核表达载体，为进一步研究山楂三萜生物合成途径提供了理论依据。

本研究为进一步通过转基因验证基因的生物学功能奠定了基础，为后续通过基因工程手段提高枸骨三萜皂苷含提供了一定的理论依据。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Cloning and prokaryotic expression analysis of farnesyl pyrophosphate synthasegene from

TU Yi, ZENG Hui, ZHANG Wei-wei, XU Feng, LIAO Yong-ling, YE Jia-bao

College of Horticulture and Gardening, Yangtze University, Jingzhou 434025, China

To clone the key gene of chalcone synthase farnesyl diphosphate synthase () in triterpenoid saponins biosynthetic pathway of, analyze tissue-specific expression of the chalcone synthase, construct the prokaryotic expression vector and induce the recombinant protein to express, explore its function in regulating the biosynthesis of triterpenoid saponins.Based on the transcriptome data ofin the previous study, the full-length cDNA ofwas cloned by PCR from the leaves ofand bioinformatics analysis was performed. The qPCR was used to further analyze the tissue-specific expression of. The prokaryotic expression vector pET32a-was constructed, transformed into BL21 (DE3) pLysS competent cells and the expression of recombinant protein was induced by IPTG.The size ofgene was 1259 bp, containing an open reading frame (ORF) of 1050 bp and encoding 350 amino acids, its protein molecular weight and isoelectric point are 40 200 and 5.54, respectively. Amino acid sequence alignment analysis showed thatamino acid sequences ofhad high homology with those of,,,and. Phylogenetic tree analysis showed that the IcFPS2 protein clustered with the FPS proteins of,ands, suggesting that the FPS protein ofmay be functionally close to the FPS protein of the dicotyledonous plant Pentaphyllaceae. Real-time fluorescence quantitative PCR analysis showed that the expression ofgene was highest in roots, followed by leaves, and then male flowers and stems, and the gene was expressed at the lowest level in female flowers. The results of the prokaryotic expression analysis showed that the constructed pET32a-vector could be successfully expressed inBL21 (DE3), and the SDS-PAGE results showed that the induced recombinantly expressed protein was around 45 000, which was basically consistent with the predicted IcFPS2 protein size.The full-length cDNA cloning and bioinformatics analysis ofgene, tissue-specific expression analysis and prokaryotic expression vector construction were used to provide scientific basis for further research on the function of farnesyl pyrophosphate synthase gene in triterpenoid saponins biosynthetic pathway of

L.; farnesyl pyrophosphate synthase; clonig; expression analysis; prokaryotic expression

R286.12

A

0253 - 2670(2022)15 - 4813 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.15.025

2021-12-13

国家自然科学基金资助项目（31500546）

涂 逸，硕士研究生。研究方向为主要从事林木次生代谢分子调控机制研究。E- mail: ty1102903626@163.com

通信作者：张威威，博士，副教授。研究方向为主要从事林木次生代谢分子调控机制研究。E-mail: wwzhangchn@163.com

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