黄芪-白茅根治疗慢性肾小球肾炎作用机制的可视化分析

祝晓丽，高家荣,2*，施苗苗，秦秀娟，魏良兵，刘涛，张魏

(1.安徽中医药大学第一附属医院，安徽 合肥 230031；2.安徽中医药大学 中药复方安徽省重点实验室，安徽 合肥 230012)

慢性肾小球肾炎(chronic glomerulonephritis ，CGN)属于中医“水肿”“尿血”“腰痛”等范畴[1]，具有起病隐匿、迁延不愈、预后差等特点，严重影响患者的生活质量，是临床研究的重点[2]。CGN是肾小球硬化和终末期肾病的最常见原因，常导致患者出现蛋白尿、血尿[3]。本病早中期无明确、有效的治疗方法，应用西药有一定的治疗作用，但经常出现不良反应且治疗作用有限。中医药在CGN治疗上优点显著，可改善患者临床症状、减轻反跳现象，保护肾脏功能及延缓肾病进展[4-6]。黄芪始载于《神农本草经》，书中谓其味甘，微温，可升可降，阳中之阳也，具有大补元气、健脾补肾、利水消肿的作用，乃补气之圣药，常用来治疗各种肾脏疾病[7]。研究表明，黄芪可促进蛋白质合成，提高血浆蛋白水平，促进尿钠排泄，改善机体水液代谢，消除水肿，缓解症状[8-10]，减少肾脏组织的损害。白茅根具有清热利尿，利水消肿，导热下行的功效[11]。陈兰英等[12]以阿霉素造模，构建大鼠模型，以白茅根的不同提取物为研究内容，发现其对模型大鼠有不同程度的保护作用，并且其作用机制可能是通过降低TGF-β1以及NF-κB p65的表达，抑制TNF-α的活性，进而改善阿霉素肾病大鼠肾组织病变。黄芪健脾益气，白茅根清热利尿，二药配伍，扶正祛邪，标本兼治，共奏健脾益气、清热利湿之功。黄芪得白茅根，固表而不致留邪；白茅根得黄芪，祛邪而不伤正，补中寓疏，散中寓补，内外兼顾。但是，黄芪-白茅根在CGN治疗中的作用机制尚不清楚。因此，本研究借助可视化工具，初步对黄芪-白茅根在CGN治疗中的作用进行探讨，为临床治疗CGN提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 黄芪、白茅根的活性成分及CGN靶点的筛选

应用BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)、TCMSP(https://tcmsp-e.com/)检索黄芪和白茅根相关的成分，为获得黄芪、白茅根的活性成分，将口服生物利用度OB ≥30%以及类药性DL ≥0.18 设为筛选条件[13-16]。通过SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)和Uniprot(http://www.uniprot.org/)获取活性成分的靶点信息[17-18]。关键词为“chronic glomerulonephritis”，使用GeneCards(https://www.genecards.org/)、OMIM(https://omim.org/) 、DisGeNET(https://www.disgenet.org/) 、Drugbank(https://go.drugbank.com/) 、DiGSeE(http://210.107.182.61/geneSearch/)数据库收集CGN疾病靶点[19-23]。

1.2 网络构建

为明确黄芪-白茅根与CGN潜在靶点间的相互作用，利用Venny 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)将药物与CGN疾病靶点取交集，获得潜在交集靶点。应用Cytoscape 3.7.1构建核心成分-靶点、药物-活性成分-交集靶点-疾病以及靶点-通路网络。本文中药物为黄芪与白茅根，核心成分是指在活性成分筛选出来的基础之上，应用Cytoscape3.7.1软件“Network Analyzer”功能，以网络整体的节点度值(degree)、介数中心性(betweenness centrality，BC)以及接近中心性(closeness centrality，CC)3个重要拓扑参数的中位数为筛选条件，筛选出来的成分。

1.3 核心蛋白质-蛋白质相互作用网络的构建

将活性成分和疾病的交集靶点上传至STRING数据库(https://string-db.org/ )[24]，获取蛋白质-蛋白质相互作用( protein-protein interaction， PPI)网络图。应用Cytoscape3.7.1软件“Network Analyzer”功能，分别以degree、BC、CC中位数为条件，筛选核心靶点，设置网络中节点大小和颜色深浅反映degree值大小[25]。

1.4 GO和KEGG分析

将潜在靶点导入Omicshare(https://www.omicshare.com/)平台，物种设置为人类，进行基因本体( gene ontology， GO)(http://geneontology.org/)分析(P<0.05)，并分别筛出前20个功能类别构建圈图，GO相关条形图由软件R 4.1.0完成。对靶蛋白进行京都基因与基因组百科全书( Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)(https://www.kegg.jp/)富集分析(P<0.05)，选择前20条KEGG通路构建圈图。

1.5 分子对接

应用AutoDock Vina以及LigPlot软件进行分子对接。结合能 ≤ 0 kJ/mol表明该化合物能与靶结合并相互作用，而结合能≤-20.93 kJ/mol表明表现出很强的结合力[26]。

2结果与分析

2.1 黄芪-白茅根活性成分及靶点筛选

从BATMAN-TCM数据库检索到黄芪35个成分，白茅根7个成分；TCMSP数据库检索到黄芪87个成分，白茅根33个成分。依据条件，共筛选出26个活性成分，其中黄芪22个，白茅根3个，1个为两者共有，主要成分见表1(全表见OSID附表1)。利用SwissTargetPrediction和Uniprot两个数据库获得271个活性成分靶点，其中黄芪有263个，白茅根有52个，44个为两者共有，按照degree、BC、CC中位数为筛选条件获得14个核心成分，并将获得信息导入Cytoscape 3.7.1，构建核心成分-活性靶点网络，蓝色三角形为成分，黄色为活性成分靶点，见图1。

表1 黄芪-白茅根部分主要活性成分筛选结果Table 1 Screening results of part of the active components of Astragali Radix-Imperatae Rhizomain

注：蓝色三角形为核心成分，黄色为相对应的靶点。图1 核心成分-活性靶点互作网络Fig.1 Core component-active target interaction network

2.2 黄芪-白茅根靶点与CGN靶点的交集分析

通过GeneCards、OMIM、DisGeNET、Drugbank、DiGSeE数据库获得2 360个CGN相关靶点，利用Venny将活性成分与疾病靶点取交集，获得143个交集靶点，上传至STRING数据库，去除游离靶点后将信息导出，通过Cytoscape 3.7.1软件对交集靶点信息分析，获得交集靶点网络图,其颜色越红表示degree值越大，见图2。

图2 成分和疾病交集靶点分析Fig.2 Analysis of the components and disease intersection targets

2.3 药物-活性成分-交集靶点-疾病互作网络构建

药物-活性成分-交集靶点-疾病互作网络中共包括169个节点，517条边，粉色菱形为药物，紫色六边形为CGN，绿色三角为活性成分，浅蓝色长方形为活性成分和CGN的交集靶点，见图3。

注：粉色菱形为药物，紫色六边型为疾病，绿色为活性成分，degree值越大绿色三角越大，浅蓝色为活性成分和疾病的交集靶点。图3 药物-活性成分-交集靶点-疾病互作网络Fig.3 Drug-active ingredient-intersection target-disease interaction network

2.4 GO分析和KEGG通路富集分析结果

2.4.1 GO功能富集分析

对黄芪-白茅根治疗CGN涉及的143个靶蛋白进行了分析，共获得7 084个GO相关过程，以P<0.05为筛选条件，筛选出差异的生物过程(biological process，BP)有3 982个相关过程，细胞成分(cellular component，CC)有233个相关过程，分子功能(molecular function，MF)有448个相关过程。按照P值从小到大的顺序选取前20做圈图，图4(a)列出了GO-BP富集结果，发现黄芪-白茅根主要涉及到含氧化合物的反应、细胞增殖、激素反应等过程。图4(b)列出了GO-CC富集分析结果，发现黄芪-白茅根主要作用于细胞膜、质膜和胞外空间。对于GO-MF富集分析，其结果在图4(c)中展现，发现黄芪-白茅根的靶标涉及信号受体结合、酶结合、蛋白质二聚化活性以及转录因子结合等。4(d)为各选取BP、CC、MF前10个相关过程所做的条形图。图4相关表格见OSID附表2～4。

图4 GO功能富集分析Fig.4 GO functional enrichment analysis

图4(续)

2.4.2 KEGG富集通路分析

对黄芪-白茅根治疗CGN涉及的交集靶点进行分析，获得230个KEGG信号通路，以P<0.05为筛选条件，筛选出差异KEGG条目159个，P值从小到大排序，对前20条信号通路分析，发现其涉及IL-17信号通路、TNF信号通路、C型凝集素受体信号通路、MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路等，主要通路见表2(全表见OSID附表5)。图5(b)中网络图红色为P值较小的前20通路，红色三角形表示通路黄色为富集在相关通路上面的相关靶点，见图5。

图5 KEGG通路富集分析Fig.5 KEGG pathway enrichment analysis

表2 药物与疾病交集靶点的部分KEGG通路富集Table 2 Part of KEGG pathway enrichment of drug and disease intersection targets

2.5 核心PPI网络的构建

将活性成分-疾病的交集数据导入Cytoscape 3.7.1软件，利用degree、BC、CC中位数为筛选条件获得55个核心靶点，再以degree值从大到小排序，筛选前10个靶点，IL-6、AKT1、VEGFA、TNF、TP53、PTGS2、JUN、CASP3、MMP9、EGF用于分子对接，见图6。

图6 药物-疾病交集靶点核心PPI网络Fig.6 Core PPI network of drug-disease intersection targets

2.6 核心成分与核心靶点对接

结果显示，所有分子与蛋白的结合能均小于-20.93 kJ/mol，说明配体能与受体自发结合，其中槲皮素(MOL000098)、异鼠李素(MOL000354)、山柰酚(MOL000422)、dihydro-6H-benzofurano[3,2-c]chromen-3-ol(MOL000380)与核心靶点TNF结合能最好，见图7。

图7 活性化合物和靶点蛋白分子对接结果及MOL000098与TNF的分子对接图Fig.7 Docking results of active compounds and target proteins and molecular docking diagram of MOL000098 and TNF

3 讨论

本文借助可视化相关工具，初步探究黄芪-白茅根治疗慢性肾炎的作用。通过TCMSP及BATMAN-TCM两个数据库的结果进行整合和删减，最终得到与黄芪-白茅根相关的活性成分27个、271个靶点。通过挖掘GeneCards、OMIM、DisGeNET、Drugbank、DiGSeE这5个疾病数据库，共获得了2 360个CGN相关靶点。通过在线工具绘制了黄芪-白茅根相关靶点和CGN相关靶点的维恩图，得到黄芪-白茅根治疗CGN的143个潜在治疗靶点。CGN作为一种自身免疫介导的肾小球损伤的慢性肾脏疾病，以循环炎症细胞浸润以及肾小球细胞增殖为特征[27-28]，其中槲皮素在药物-活性成分-交集靶点-疾病网络中degree最高，被认为是潜在的活性成分，在CGN的治疗中起着关键的作用，表现出较强的抗炎和抑制增殖的作用。Yuan等[29]发现槲皮素可通过抑制中性粒细胞炎症反应减轻炎症进展；Liu等[30]发现槲皮素还可降低TNF-α诱导的系膜细胞增殖，抑制PTX3生成，参与NF-κB信号通路；Ishikawa等[31]通过对总细胞数、有丝分裂细胞的百分比和[(3) H]-胸苷的掺入进行评估，3种测定都表明槲皮素显著减弱了大鼠肾小球系膜细胞的促有丝分裂活性。用过氧化氢或TNF-α 刺激，来研究槲皮素对细胞凋亡的影响，最终发现槲皮素具有在体外和体内抑制肾小球细胞有丝分裂和凋亡的潜力。

对药物和疾病的交集靶点进行GO分析，探讨其生物学机制，提示黄芪-白茅根药对CGN的治疗机制是多个靶点的结合。发现黄芪-白茅根药对主要涉及到含氧化合物的反应、细胞增殖、激素反应等过程。基于药物和疾病交集靶点的KEGG富集分析，发现黄芪-白茅根治疗CGN的潜在通路与IL-17信号通路、TNF信号通路、MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路等信号通路密切相关，IL-17A和IL-17F可以单独诱导促炎基因表达，特别是与TNF-α、IL-6、G-CSF、IL-1、CXCL、CCL20和基质金属蛋白酶协同作用。IL-17通过激活NF-κB、MAPK和C/EBP级联途径上调这些致炎基因[32]。经典的PI3K-AKT通路调节许多慢性肾脏疾病的发展过程，包括增殖和炎症，是慢性肾脏疾病中上调最频繁的途径，包括CGN[33]。慢性肾小球肾炎炎性损伤主要包括炎性因子异常高表达、炎症信号通路激活等，其中p38MAPK炎症信号通路在肾组织炎性病变过程中具有重要意义[34]。

基于中药活性成分与疾病潜在靶标之间的相互作用，网络药理学方法可从网络拓扑分析中识别潜在的机制和关键靶标。可用于确定草药成分的协同作用，了解中药配方的组合规则，并最终帮助临床医生合理地设计中药配伍[35]。分子对接技术在药物靶标结合预测和合成药物设计中起着重要作用，能够预测药物配体和蛋白质受体的对接模式和结合亲和力(表明对接模式的稳定性)。我们对筛选出的核心成分和核心靶点进行了分子对接，以验证网络药理学的结果。IL-6、AKT1、VEGFA、TNF、TP53、PTGS2等55个蛋白靶点是黄芪-白茅根治疗CGN过程中的关键靶点，提示黄芪-白茅根可能通过调控这些靶点发挥作用，改善CGN。有研究发现[36]，肾组织中的细胞因子失衡表现为促炎性 IL-17、IL-6、TNF-α水平升高以及抗炎性IL-10和T调节细胞水平降低，细胞因子的失衡反映了CGN的高活性和疾病进展的风险。基于核心PPI网络分析，我们选择了10个靶点用于后续分子对接。从活性成分-活性靶点网络中按照degree、BC、CC中位数为筛选条件获得了靶向这些蛋白质的14个核心成分，包括槲皮素、异鼠李素、山柰酚等。采用AutoDock Vina和LigPlot进行对接并且使用PyMOL软件可视化，见图7。在我们选择的10个核心靶点中，TNF与槲皮素、异鼠李素、山柰酚以及dihydro-6H-benzofurano[3,2-c]chromen-3-ol的结合亲和力最低。

综上所述，本研究应用网络药理学和分子对接阐述了黄芪-白茅根的活性成分、靶点及通路之间相互作用的关系，黄芪-白茅根的活性成分可通过多靶点、多通路发挥治疗CGN的作用，为黄芪-白茅根治疗CGN的提供了理论依据。