山东新分布药用植物碎米桠的DNA条形码分子鉴定

葛俊伟, 李平, 张童童, 高飞, 王文越, 王钧楠， 孙稚颖*

(1.山东中医药大学，山东 济南 250355; 2. 北京中医药大学，北京 102488)

为摸清中药资源家底，确保我国中医药事业的可持续发展，从2011年起，全国各地陆续开展了第四次中药资源普查工作[1]。本课题组在山东省滕州市野外进行资源普查的过程中，发现了一种野生唇形科植物。通过形态观察，判断其为香茶菜属(Isodon(Schrad. ex Benth.) Spach)植物，并且该植物与有山东分布记录的香茶菜属内折香茶菜(Isodoninflexus(Thunb.) Kudo)较为相似，但也有差异，如雄蕊、花柱伸出，而内折香茶菜雄蕊、花柱内藏。进一步鉴定发现该植物与无山东分布记录的碎米桠(I.rubescens(Hemsl.) Hara)更为相似。香茶菜属为唇形科植物，木本或草本；根茎常肥大木质，叶具齿。聚伞花序，花具梗[2]。属内多种植物入药，如碎米桠，《中国药典》收载，其干燥地上部分作冬凌草入药，具有清热解毒、活血止痛功效[3]，对多种癌症的症状有缓解作用[4]。此外，内折香茶菜也有抗肿瘤作用[5]。在野外仅凭宏观特征无法准确判断该未知植物物种，因此有必要进行更深入的鉴定研究，从而为新资源的开发利用提供依据。

DNA条形码技术能实现对中药材方便快捷的鉴定。核ITS2序列与叶绿体psbA-trnH序列作为DNA条形码现在被广泛应用于药用植物资源鉴定，并被收录于2015版和2020版《中国药典》第四部[6-7]，而且前人也做了大量研究，如psbA-trnH序列在薯蓣属[8]、沉香属[9]等中药材的物种鉴定中的作用已得到证实，ITS2序列在板蓝根[10]、白前[11]、乌头属[12]等中药材的物种鉴定中同样得到很好的应用。

因此，本研究将利用核基因组ITS2片段以及叶绿体基因组psbA-trnH基因间隔区作为DNA条形码序列，对所调查物种进行分子鉴定，同时从GenBank下载相关可靠序列进行比对分析，旨在对所发现的这一野生植物进行准确的物种鉴定，进而为其资源开发利用等相关研究提供证据。

1 材料、试剂与方法

1.1 实验材料

所研究植物样品(wz)采自山东省滕州市滨湖镇双井村东南山坡，拍照观察，经初步外部形态观察后，单株取样，随机取3份不同植株个体幼嫩叶片(wz1，wz2，wz3)，硅胶干燥备用。凭证标本保存于山东中医药大学生药系标本室(标本号为：370481181013001LY)。

1.2 试剂与仪器

试剂主要包括：GeneRed核酸染料；2×Taq PCR MasterMIX(含染料)；5×TBE Buffer；DL2000 marker；植物基因组DNA提取试剂盒(天根生物技术(北京)有限公司)等。

仪器主要包括：SYG-2恒温水浴锅(常州朗越仪器制造有限公司)；1-14高速离心机(德国SIGMA公司)；DYY-8B稳压稳流电泳仪(北京六一生物科技有限公司)；T100 Thermal Cycler热循环仪(美国Bio-rad公司)；LUMINESCENT Amersham Imager 600图像分析仪(瑞典GE Healthcare Bio-Sciences AB公司)；XFS-280CB手提式压力蒸汽灭菌锅(浙江新丰医疗器械有限公司)；303-OB电热恒温培养箱(绍兴市沪越仪器设备厂)等。

1.3 方法

1.3.1 总DNA的提取

取干燥叶片约30 mg，于研钵内加液氮迅速研磨，用植物基因组DNA提取试剂盒参照说明书方法提取材料总DNA，，置于-20 ℃冰箱备用。

1.3.2 PCR扩增及测序

PCR扩增体系为25.0 μL：包括DNA模板2.0 μL，双向引物各1.0 μL(浓度2.5 μmol/L)，2×Taq PCR MasterMIX12.5 μL，双蒸水(约8.5 μL)补足至25 μL。PCR扩增反应条件及扩增实验程序参考2015版、2020版《中国药典》第四部等的研究方法[6-7,13]。PCR扩增产物经电泳检测后，切胶纯化，使用ABI 3730XL测序仪双向测序。

PCR扩增及测序引物信息见表 1。

表1 引物信息Table 1 Information on primers

1.3.3 数据分析

所得序列利用软件Chromasv校对拼接，对于核序列，切除两端5.8S和28S碱基序列得到样品的ITS2序列；对于叶绿体序列，切除两端引物序列，得到psbA-trnH序列，NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)网站进行Blast比对，并分别下载相关物种的ITS2和psbA-trnH序列，然后用软件MEGA6.0进行数据分析，并利用邻接法(neighbor-joining，NJ)构建距离树[14-15]。

2 结果与分析

2.1 植物外部形态观察

木质根；叶对生，卵圆形，先端渐尖，基部楔形，骤然渐狭下延，边缘具锯齿，叶膜质，上下表面被柔毛至近无毛；唇形花冠，红至紫色，雄蕊4，伸出，花柱伸出；花盘环状。

依据外部形态观察，初步推断所调查物种与内折香茶菜相似，与《中国植物志》英文版FloraofChina[2]中碎米桠形态更为吻合。

注：箭头示主要鉴别特征。图1 植物形态图Fig.1 Morphology of the studied species

2.2 基因序列分析

2.2.1 ITS2序列

为了更好地确定该物种，从GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)下载了几条碎米桠与内折香茶菜ITS2序列以作比较分析。通过分析发现，所测3株植物样品ITS2碱基序列长度均为212 bp，GC含量为67.9%，3株植物个体碱基序列完全一致。与GenBank中所下载的碎米桠(Sequence ID:KF032250、KT285125、JQ389511、JQ389509)序列比对也无差异，与内折香茶菜(Sequence ID:KF032264、KF032265、KF032266)有7个位点差异，见表 2。同时经NCBI网站上Blast比对，本实验所研究样品与碎米桠的相似度为100%，构建系统聚类树见图2。可明显看出，所研究样品(wz1，wz2，wz3)与GenBank所下载碎米桠聚在一支。

表2 所研究植物样品的ITS2差异位点信息Table 2 Information on different ITS2 loci in the studied samples

图2 基于ITS2序列构建NJ距离树Fig.2 Phylogenetic tree construction based on ITS2 sequences using the NJ method

2.2.2psbA-trnH序列

为了更好地鉴定该物种，从GenBank下载了内折香茶菜和碎米桠psbA-trnH序列，通过对实验结果分析，所测3株不同个体样品碱基序列长度均为391 bp，GC含量为29.7%，居群内个体间碱基序列无差异。与GenBank所下载序列比较，差异位点信息见表3。

表3 所研究植物样品的psbA-trnH差异位点信息Table 3 Information on different psbA-trnH loci in the studied samples

其中KF855542两端碱基序列不完整，根据Kimura 2-Parameter (K2P)遗传距离分析得出，样品与GenBank中提交的碎米桠(Sequence ID:FJ513119、KF855542)差异较小，遗传距离为0.003～0.005；与内折香茶菜(Sequence ID:FJ513099、KF032288)差异较大，遗传距离为0.026～0.027。利用邻接法构建系统聚类树见图3，可以看出该研究物种与碎米桠聚在一支。

图3 基于psbA-trnH序列构建NJ距离树Fig.3 Phylogenetic tree construction based on psbA-trnH sequences using the NJ method

3 讨论

本研究利用DNA条形码技术对野外资源调查中所发现的形态鉴定不确定物种进行了分子鉴定，所采用的方法便捷、可靠，减少了客观环境与主观因素造成的误差，保证了结果的准确性。DNA条形码分别使用了核基因组ITS2序列与叶绿体基因组psbA-trnH序列。此外，从GenBank所下载作对比分析的序列均经过严格筛选溯源，保证其来源的准确性和可靠性，如KF855542来自中科院西双版纳植物园Yu等[16]发表在MolecularPhylogeneticsandEvolution上的文章，该文从系统发育学和生物地理学角度研究了香茶菜属植物的快速辐射进化。JQ389511、JQ389509样品采自中国河南省北部，论文发表在PLoSOne，作者采用系统发育学和居群遗传学相结合的方式筛选中国香茶菜属植物中冬凌草甲素含量丰富的物种资源，研究结果表明河南省所产碎米桠和毛叶香茶菜可以提供最好的冬凌草甲素来源[17]。KF032288、KF032250、KF032264、KF032265、KF032266来自夏至等[18]发表在《中草药》上的文章，该文对碎米桠及其近缘种进行了分子鉴定，研究结果表明，碎米桠与毛叶香茶菜、香茶菜和内折香茶菜亲缘关系较近，ITS和psbA-trnH 序列可以准确鉴别碎米桠及其近缘种。其余三条序列均来自Chen等[19]和向丽等[20]所提交序列。

通过DNA条形码核基因组ITS2序列与叶绿体基因组psbA-trnH序列分析结果可以佐证作者野外形态观察推论，判断所研究样品应该为碎米桠。本研究结果支持夏至等所发表文章观点。但这两种序列也有所差异，相比较而言，针对该物种，核基因组ITS2序列比叶绿体基因组psbA-trnH基因间隔区序列分辨力更高。差异主要是由于核基因来自双亲遗传，而叶绿体基因是母系遗传。

本实验研究材料采自山东省滕州市，为全国第四次中药资源普查中所发现，后在调查济南市长清区中药资源时，在灵岩山附近也有发现，根据实验结果可知此香茶菜属资源植物为碎米桠，而《山东植物志》《山东植物精要》《山东药用植物志》等均没有收载该物种[21-23]，也未见相关文献报道其在山东有分布，因此认为碎米桠是山东境内新分布种。这一结论有助于补充和完善山东省的中药资源数据库，同时作为具有抗癌等多种活性的药用植物资源，碎米桠在山东省的分布与发现，对该资源的开发和可持续利用具有重要意义。