基于响应面法的瑞士乳杆菌NXU_19022 发酵枸杞汁工艺优化

李旭阳， 潘 琳， 刘慧燕， 胡明珍， 方海田

（1.宁夏大学食品与葡萄酒学院，宁夏银川 750021；2.宁夏食品微生物应用技术与安全控制重点实验室，宁夏银川 750021）

枸杞（Lycium barbarumL.）是宁夏著名特产，其果实中含有丰富的营养物质，主要包括多糖、多肽、生物碱、黄酮类、萜烯类、有机酸、木脂素、酚酰胺、类胡萝卜素等多种化合物，具有不同的药理活性和保健作用[1-3]。枸杞不仅具有滋补肝肾、清肝明目、补血安神、延寿益精等功效，还可以通过阻断流感病毒表面蛋白和刺激机体的免疫系统，用于预防和治疗流感。枸杞中的蛋白质、脂肪、糖类和多种氨基酸、胡萝卜素、大量维生素、微量元素可以改善人体的血液循环，增强人体免疫力和提高人体抗氧化效力[4-6]。

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是一类对宿主有益的活性微生物，进入并定植在胃肠道后，能够与宿主共生，从而构成一个复杂的微生态环境[7]。乳酸菌不仅可以调节人体代谢平衡，还是发酵产品中的主要微生物[8]。其在发酵过程中，不仅可以改善食品本身带有的气味及产品特性，还可以提高产品营养价值[9-11]。此外，乳酸菌在发酵过程中，产生大量的蛋白酶及各种微量的脂肪酶，可将食品中的大分子物质蛋白质和脂肪降解为更易被人体吸收的小分子氨基酸及脂肪酸等。其自身不仅可以合成维生素B1、B2、B3、B5 等，还可以产生某些游离氨基酸或氨基酸衍生物，抑制丙烯酰胺的合成[12-13]。乳酸菌在食品行业应用广泛，常被用来发酵酸奶及其他乳制品、蔬菜以及肉制品等[14]。

本文以宁夏枸杞为原料，选用瑞士乳杆菌NXU_19022 进行枸杞汁发酵，通过发酵时间、接菌量、加糖量进行单因素试验，以乳酸产量为评定条件确定发酵工艺参数，采用响应面法对发酵条件进行优化。以期为发酵枸杞工业提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

枸杞（市售）；异抗坏血酸（天津市化学试剂一厂）；柠檬酸（伟博鑫生物公司）；FR980 恒温培养箱（上海复日科技有限公司）；HH-3A 数显恒温水浴锅（上海丙林电子科技有限公司）；PHSJ-3F 实验室pH 计（上海仪电科学仪器股份有限公司）；SBA-40E 生物传感分析仪（山东省科学院生物研究所）。

1.2 试验方法

1.2.1不同加糖量对枸杞汁乳酸含量的影响 将枸杞汁和水以1∶5 的比例混合浸泡5～6 h，浸泡时加入0．05%（w/v）异抗坏血酸钠，在浸泡结束后加入0．15%（w/v）的果胶酶，混匀后进行打浆。将打浆完的枸杞汁进行过滤，滤去枸杞籽，并用柠檬酸将枸杞汁的pH 调整为4．5，加糖量设为料液的3%、4%、5%、6%、7%，混匀后进行55 ℃，25 min 水浴巴氏杀菌。水浴后将培养好的乳酸菌以5%的接种量接入枸杞汁中，轻轻摇晃，放入37 ℃培养箱中培养14 h。测定乳酸产量。

1.2.2不同发酵时间对枸杞汁乳酸含量的影响 同1．2．1，加糖量设定为5%，将发酵时间分别调整为8、10、12、14、16 h。发酵结束测定乳酸产量。

1.2.3不同菌液添加量对枸杞汁乳酸含量的影响同1．2．1，加糖量设定为5%，将菌液添加量分别调整为料液的3．50%、4．00%、4．50%、5．00%、5．50%，发酵14 h，发酵结束后测定乳酸产量[15-16]。

1.2.4响应面优化 基于单因素试验结果，利用Box-Behnkeu 响应面设计，在上述3 个单因素变量中选取3 个影响显著的发酵条件作为响应面分析的自变量，以发酵完成后枸杞汁的乳酸产量作为响应值，对发酵枸杞汁的发酵工艺进行优化[17-18]。

1.2.5发酵后的枸杞汁中多酚含量测定 吸取1．0 mL适当稀释的枸杞汁于10 mL 比色管中，加入2．5 mL福林酚试剂，摇匀，加入2．5 mL 15%的Na2CO3溶液，其加入样品、福林酚试剂、15%Na2CO3溶液的比例为1∶2．5∶2．5，加水定容至刻度，摇匀。40 ℃水浴60 min，静置冷却20 min，测定其在波长778 nm 时的吸光度值。其标准曲线的制作为：吸取200 mg/L没食子酸0．0、0．2、0．4、0．6、1．0、1．5 mL，分别置于10 mL容量瓶中，用60%乙醇溶液定容，得到没食子酸工作液。然后分别取没食子酸工作液1．0 mL 于10 mL比色管中，再根据比例加入福林酚试剂和15%Na2CO3溶液。以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。根据标准曲线计算待测液中总多酚的浓度[19-20]。

1.2.6发酵后枸杞汁中多糖含量测定 使用苯酚-硫酸法测多糖[21-22]。取枸杞汁10 mL，加入30 mL 95%乙醇于4 ℃下静置24 h，用滤布过滤并用冷乙醇冲洗沉淀2 次，风干后用40 mL 水溶解沉淀。取上述水溶液1 mL 加入1 mL 5%苯酚溶液，再向混合液中加入5 mL 浓硫酸，充分混匀，静置10 min，再置于40 ℃水浴锅15 min，后立即冷却至室温，测定其在490 nm 波长下吸光度。其标准曲线制作：取0．1 mg/mL 葡萄糖0．1、0．2、0．4、0．6、0．8、1．0 mL 至具塞试管中，分别加水定容至2．0 mL，加1 mL 5%苯酚溶液，摇匀后加入5 mL 浓硫酸摇匀，其余操作参照枸杞汁多糖测定。带入标准曲线中计算枸杞汁中多糖的浓度。

1.2.7数据处理 利用Excel 2019 进行数据整理，SPSS 2．0 进行t 检验，使用Origin 8．0 作图，Design Expert 8．0．6 软件进行响应面数据分析及方差分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

由图1—图3 及表2 可以看出，加糖量从3%增加到4%时，乳酸产量增加。但当加糖量高于4%时，乳酸产量会下降，可能是糖含量过高，使发酵液的浓度和渗透压升高，抑制了乳酸菌的生长，从而造成乳酸含量降低，故将加糖量定为4%；接菌量从3．5%增加到4．5%时，乳酸产量在不断增加，但当再增加接菌量时，乳酸产量趋于平稳或增加量减少，可能是接菌量过大，无法满足乳酸菌代谢所需营养物质，抑制了乳酸菌的生长代谢，故将接菌量定为4．5%；发酵时间从8 h 增加到16 h 时乳酸产量在不断增加，但从8 h 至14 h 间每2 个小时内乳酸产量的差值都有所增加，而从14～16 h 间乳酸产量差值下降，可能是发酵液中酸度过高，不利于乳酸菌的生长，故将发酵时间定为14 h。

图1 加糖量不同时乳酸产量

图3 发酵时间不同时乳酸产量

表1 单因素试验结果

图2 菌液添加量不同时乳酸产量

2.2 响应面法优化试验条件

根据单因素试验的结果，利用Box-Behnken 实验以加糖量（A）、菌液添加量（B）和发酵时间（C）为自变量；以乳酸产量为响应值，进行三因素三水平的响应面试验[23-24]。

以乳酸产量为响应值，回归分析见表2 和表3，对各因素回归拟合后，得到回归方程为：Y1=372.00+1.87×A+4.38×B+3.75×C-8.75×AB-10×AC-10×BC-21.62×A2-26.63×B2-25.38×C2该模型值F=134.23，（P＜0.0001），说明试验模型为极显著，在统计学上有意义。失拟项不显著（P＞0.05），说明没有产生失拟现象，表明模型合理，可以使用该模型推测试验结果。模型中一次项A、B、C，对响应值都有极显著的影响，交互项BC、AB、AC 对响应值均有显著影响。二次项A2、B2、C2 有极显著的影响。根据F值大小可知，各因素对乳酸产量影响的主要因素为B>C>A，即接菌量>发酵时间>发酵温度。

表2 Box-Behnken 试验方案及结果

表3 以产量为响应值的回归模型及方差分析

通过图4—图6 可直观地看出各因素交互作用对乳酸产量的影响。曲线越陡峭，表明响应值对于实验条件的改变越敏感，同理，曲面坡度越平缓，实验条件的改变对响应值的影响也就越小。图4 显示加糖量与菌液添加量交互形成的曲面坡度陡峭，说明两者交互作用对乳酸产量的影响很大，达到显著水平。图5 显示加糖量与发酵时间交互形成的曲面坡度陡峭，说明两者交互作用对乳酸产量的影响很大，达到显著水平。图6 显示菌液添加量与发酵时间交互形成的曲面坡度陡峭，说明两者交互作用对乳酸产量的影响很大，达到显著水平。

图4 加糖量和菌液添加量对乳酸产量影响的响应面图

图5 加糖量和发酵时间对乳酸产量影响的响应面

图6 菌液添加量和发酵时间对乳酸产量影响的响应面图

根据响应面法分析得到最佳发酵条件，详见表4。

表4 最佳发酵条件

2.3 发酵前后枸杞汁中多糖、多酚质量浓度变化

枸杞多糖（Lyciumbarbarumpolysaccharide，LBP）是枸杞中活性成分中的一种水溶性多糖，其是一种对人体健康有益的活性物质，具有促进免疫、抗氧化、降血糖血脂等作用[25]。实验表明，不同菌株发酵的枸杞汁，其多糖含量不同可能是菌株产生胞外多糖。其中NXU_19006 菌株发酵枸杞汁后多糖含量增加较多。从表6 中可以看出多酚含量与未发酵枸杞汁多酚含量相比下降，这可能是因为酚类物质又作为营养物质被乳酸菌代谢利用了。其中多酚的标准曲线为：y=0.125 2x-0.014 8，R2=0.999 8；其多糖标准曲线为：标准曲线y=0.824 3x-0.0098，R2=0.999 3。

表5 发酵前后多糖、多酚质量浓度变化 mg/mL

3 结论

本文通过乳酸菌菌株瑞士乳杆菌NXU_19022进行枸杞汁发酵工艺的优化，以乳酸产量为评定条件，进行发酵时间、菌液添加量和加糖量关键指标的测定，以响应面法对发酵工艺进行优化，得到最优发酵条件为：发酵时间12 h、菌液添加量为4.5%、加糖量为4%。并对发酵后枸杞汁中多糖多酚类物质进行测定，发酵后枸杞汁多糖含量增加，多酚物质含量下降。综上，瑞士乳杆菌发酵枸杞汁，可以提高枸杞汁中乳酸含量和多糖含量。