参地颗粒对系膜增生性肾炎大鼠细胞外基质ColⅠ、ColⅢ及Megsin的干预作用*

曹曼 马从显 吕勇 金华 王亿平

(1．安徽中医药大学，安徽 合肥 230012；2.安徽中医药大学第一附属医院，安徽 合肥 230031；3.六安市中医院，安徽 六安 237011)

系膜增生性肾小球肾炎(mesangial proliferative glomerulonephritis，MsPGN)是我国发病率较高的一组原发性肾小球疾病，其主要病理特征表现为弥漫性肾小球系膜细胞增生和肾小球系膜质增加。研究表明，肾小球系膜细胞(mesangial cells，MC)增生可引起多种ECM成分增多，主要包括Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白、纤维连接蛋白等，ECM积聚是导致肾小球硬化的主要原因之一[1-4]。参地颗粒具有健脾益肾、固摄精微功效，前期研究[5-9]已证实参地颗粒可通过调节相关细胞因子水平，有效改善慢性肾炎患者中医临床症候，消减尿蛋白。为进一步探究参地颗粒作用机理，本实验研究通过观察参地颗粒对MsPGN模型大鼠细胞外基质ColⅠ、ColⅢ、Megsin的干预作用，明确其肾脏保护机制。

1 仪器与材料

1.1仪器 JW3201HR离心机(安徽嘉文仪器装备有限公司)；DNP-9052BS-Ⅲ电热恒温箱(上海三发)；LEICA RM2135病理切片机(德国徕卡公司)；QP-B切片漂烘仪(合肥电子研究所)；YB-7B石蜡包埋机、ZT-12M自动脱水机(湖北亚光医用电子技术有限公司)；AT-648半自动化生化分析仪(上海博迈杰生物科技有限公司)；88-1 搅拌仪(北京国华科技集团有限公司)；HEAL FORCE NW纯水仪(香港力康生物医疗公司)；NIKON 80显微镜(日本尼康公司)。

1.2试药 参地颗粒：药物剂量10 g/袋(1 g约合生药3.4 g)，本院院内制剂(皖药制字BZ20080025)。缬沙坦胶囊：80 mg/粒，北京诺华制药有限公司生产，国药准字Z20040217；Thy-1抗体(美国Biolegend公司,批号202502)；ColⅠ+bs-0578R、ColⅢ+BA0326、FN+bs-4859R、Megsin+bs-0815R(北京博奥森生物科技有限公司，批号分别为130724W、15217、AE12306326、OH06302616)；苏木素(BA-4041)、伊红(BA-4024)、Masson+BA-4079B(珠海贝索生物技术有限公司，批号分别为716092、716101、616041)。

1.3实验动物 由安徽中医药大学实验动物中心提供60只体质量180～220 g清洁级雄性SD大鼠，许可证号：SCXK(沪)2013-0006。

2 方法

2.1造模方法及分组 70只雄性SD大鼠在动物房适应性喂养1 w后，按单纯随机抽样原则，正常组取10只大鼠行假手术处理，余下大鼠参照改良尾静脉注射抗体法[10-11]注射Thy-1抗体，制作MsPGN大鼠模型。具体方法：手术切除大鼠左侧肾脏并缝合切口，术后1 w，行尾静脉注射Thy-1抗体(2.5～3)mg·kg-1，1 w后以同样方法再次注射Thy-1抗体，注射完成后检测大鼠尿蛋白，尿蛋白阳性提示MsPGN模型造模成功。在造模过程中死亡10只，剔除留取标本不合格5只，共建立MsPGN模型大鼠45只，编号为1～45，依照随机数字表法，分为实验组、对照组、模型组，每组15只。正常组大鼠10只。

2.2给药方法 参照不同种属动物间等效剂量直接折算法[12]，实验组按照4.0 g·(kg·d)-1参地颗粒药量，对照组按缬沙坦10.3 mg·(kg·d)-1，溶解药物配制药液，每只大鼠每次3 mL药液灌胃，每日1次；给予正常组和模型组每日同等量温水灌胃。疗程12 w。

2.3指标检测 分别于造模后0、6、12 w收集大鼠尿液，检测24 hUPr。灌胃结束后取大鼠血清，生化法检测Scr和BUN；酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测血清ColⅠ、Col Ⅲ和Megsin；免疫组化法检测肾组织ColⅠ、Col Ⅲ、Megsin表达，Image Pro plus6.0多媒体彩色病理图像分析软件分析检测染色部位蛋白阳性表达的平均光密度(MOD)；采用苏木精-伊红(HE)染色切片、过碘酸六胺银(PAS)染色及Masson染色观察肾组织形态学变化。

2.4统计学方法 应用SPSS 23.0软件分析。计量资料若满足正态性及方差齐性，采用t检验；若计量资料不符合正态分布或方差不齐则采用非参数秩和检验；计数资料应用卡方检验；P<0.05认为差异具有显著性。

3 结果

3.1一般情况比较 正常组大鼠整体状态佳，好动活跃，毛发光泽，摄食可。造模大鼠全部呈现精神萎靡状态，毛发干枯，活动少喜卧，饮食量较前减少等。灌胃过程中，实验组死亡2只，对照组死亡3只，共计入实验组13只、对照组12只、模型组15只、正常组10只进入统计分析。灌胃结束后，实验组和对照组大鼠精神好转，活动和摄食量增加，实验组大鼠比对照组改善更明显。模型组无显著改变。

3.2各组大鼠24 hUPr比较 造模后模型组、对照组和实验组24 hUPr较正常组升高(P<0.05)，提示模型复制成功。给药6 w后，对照组与实验组24 hUPr比较无差异(P>0.05)，但两组与模型组24 hUPr比较，有显著差异(P<0.05)；给药第12 w，实验组与对照组24 hUPr有显著差异(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠24 hUPr比较(mg·24 h-1)

3.3各组大鼠Scr、BUN值比较 给药12 w，模型组大鼠BUN、Scr较正常组升高(P<0.05)；对照组和实验组BUN、Scr均较模型组下降(P<0.05)，但两组比较差异无显著性(P>0.05)。见表2。

表2 各组大鼠Scr、BUN值比较

3.4各组大鼠血清ColⅠ、ColⅢ、Megsin比较 给药12 w后，模型组大鼠血清ColⅠ、Col Ⅲ、Megsin与正常组相比明显增多(P<0.05)；实验组、对照组大鼠血清Col Ⅰ、Col Ⅲ、Megsin较模型组明显减少(P<0.05)；但实验组大鼠血清ColⅠ、ColⅢ、Megsin较对照组下降明显(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠血清中ColⅠ、ColⅢ、Mesgin比较

3.5各组大鼠肾组织ColⅠ、ColⅢ、Megsin表达水平 比较模型组大鼠肾组织中ColⅠ、Col Ⅲ、Megsin表达明显高于正常组(P<0.05)；与模型组相比，实验组和对照组大鼠肾组织中ColⅠ、ColⅢ、Megsin的表达均显著降低(P<0.05)；实验组大鼠肾组织ColⅠ、ColⅢ、Megsin表达较对照组降低更明显(P<0.05)。见图1～图12，表4。

图1 ColⅢ正常组(400倍) 图2 ColⅢ模型组(400倍) 图3 ColⅢ对照组(400倍) 图4 ColⅢ实验组(400倍)

图5 ColⅢ正常组(400倍) 图6 ColⅢ模型组(400倍) 图7 ColⅢ对照组(400倍) 图8 ColⅢ实验组(400倍)

图9 Megsin正常组(400倍) 图10 Megsin模型组(400倍) 图11 Megsin对照组(400倍) 图12 Megsin实验组(400倍)

表4 各组大鼠肾组织ColⅠ、Col Ⅲ和Megsin表达水平比较

3.6各组大鼠肾脏组织形态学变化(见图13-图24) 正常组：肾小球形态正常，未见系膜细胞增生和ECM增多；模型组：MC伴基质弥漫增生，肾小球体积增大并出现节段性硬化和球囊粘连，间质内可见炎性细胞浸润；实验组与对照组：MC及基质增生比模型组显著改善，间质内见轻微炎性细胞感染，然而镜下病理呈现，实验组比照组轻。

图13 PE染色正常组(400倍) 图14 PE染色模型组(400倍) 图15 PE染色对照组(400倍) 图16 PE染色治疗组(400倍)

图17 Masson染色正常组(400倍) 图18 Masson染色模型组(400倍) 图19 Masson染色对照组(400倍) 图20 Masson染色治疗组(400倍)

图21 PAS染色正常组(400倍) 图22 PAS染色模型组(400倍) 图23 PAS染色对照组(400倍) 图24 PAS染色实验组(400倍)

4 讨论

MsPGN是我国常见原发性肾小球疾病，病理特征主要表现为弥漫性肾小球系膜细胞增生及系膜ECM的积聚，ECM进行性积聚可加速肾小球硬化的进程。Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白属纤维型胶原蛋白，在体内难以被降解吸收，在ECM积聚过程中，Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白呈高表达状态，并以胶原纤维形式参与其中。研究表明，Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白合成的启动和增多可以正反馈促进系膜细胞合成ECM成分，加快肾小球硬化进程[13-16]，在疾病后期主导病变的预后。Megsin集中在肾小球系膜区，属于丝氨酸蛋白酶抑制剂(Seprin)超家族的新成员，特异表达于人、大鼠的系膜细胞中。Megsin表达上调能够引起ECM增生，加重肾脏损害[17-19]，其主要机制可能是Megsin能与纤溶酶共价结合，继而抑制纤溶酶活性，使肾小球中增生的基质成分难以降解，促进肾炎进展有关[20]。

参地颗粒由新安医学名方—人参汤化裁而来，以新安医学“立法重温补、着眼在肾”为立方法则。全方君以红参补气；茯苓健脾、熟地补肾为臣；佐以五味子、桑螵蛸和鸡内金固摄下泄之精微，川芎行气活血以祛瘀。诸药合用，共奏健脾益肾以固摄、益气活血以祛瘀之功。前期临床研究表明该方可消减慢性肾炎脾肾亏虚证患者尿蛋白并改善临床症状[5]；后续对其作用机制研究证实，该方可通过抑制免疫炎症反应、氧化应激、减轻肾血管内皮损伤和抗肾纤维化发挥治疗作用[6-9]，其中抑制ECM的增生和积聚是其重要治疗机制之一。根据“肾病微型癥瘕”理论，慢性肾炎ECM的积聚则相当于中医的瘀血、湿浊壅阻肾络，参地颗粒针对慢性肾炎脾肾亏虚之基本病机，以扶正固本，寓通于补的治疗原则而组方。方中主要以红参甘温益气，合辛温之川芎温通行气活血，配茯苓益气健脾渗湿，如此瘀血去、水湿消，扶正以祛邪，邪去则正安。本实验研究表明MsPGN大鼠细胞外基质成分ColⅠ、Col Ⅲ明显增多，伴Megsin水平上调；参地颗粒能够降低MsPGN大鼠血清和肾组织细胞外基质成分ColⅠ、Col Ⅲ含量，下调Megsin水平，消减尿蛋白，减轻大鼠肾脏病理损害，并对肾功能有一定的改善效果。本研究结果表明参地颗粒可以减轻大鼠肾脏ECM的积聚，延缓肾纤维化，保护肾功能。此与参地颗粒“扶正以祛邪”的中医治则相符，进一步从微观辨治角度佐证了参地颗粒的中医证治机理。