利用网络药理学探讨不同中成药治疗新型冠状病毒肺炎的作用机制

黄浪浪，徐 驲，刘言薇，王建安，万 强，刘中勇

(1江西中医药大学研究生院，江西 南昌 330004； 2江西中医药大学附属医院，江西 南昌 330006)

新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease 2019,COVID-19)是指人体感染新型冠状病毒而引起的急性肺炎，是一种具有强传染性、易于流行的呼吸系统疾病。据世界卫生组织实时统计数据显示，截至北京时间2021年4月22日7时，全球确诊COVID-19人数超1.44亿例，累计死亡病例超307万例，目前全球已有24个国家COVID-19确诊病例超过100万例[1]。该病早期会引起发热、干咳、乏力等一般症状，严重者甚至可以导致呼吸衰竭或脓毒症休克，危及生命。目前治疗该疾病以中西医结合对症治疗为主，无抗病毒的特效药物和疫苗。在此期间，中医药在COVID-19治疗中发挥着重要作用，具有明显疗效。新型冠状病毒在中医学中归属于“疫病”“瘟疫”等范畴，在国家卫生健康委员会修订的第四版至第八版《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案》[2-6]中对于医学观察期中的乏力伴发热患者都推荐使用金花清感颗粒(JHQGKL)、连花清瘟颗粒(LHQWKL)和疏风解毒颗粒(SFJDKL)3种中成药(以下简称“三方”)。虽然此三方疗效确切，但其作用于COVID-19的分子机制尚未完全清楚，且较少对三方治疗疾病的机制进行共性与比较研究。

网络药理学是基于生物信息学手段，通过构建“中药-活性成分-靶点-疾病”网络对中药复方进行分析，以了解药物对疾病的影响情况，与中医的整体观念相吻合。本研究通过网络药理学的方法对三方构建多层次生物信息网络，挖掘三方治疗COVID-19的分子机制，为中医药治疗COVID-19提供理论依据。

1 对化合物-靶点-通路-疗效相关数据库进行检索

1.1 三方药物活性化合物的筛选

利用中药系统药理学分析平台TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php)、BATMAN-TCM数据库(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)的检索功能，以金花清感颗粒中“金银花、连翘、麻黄、石膏、苦杏仁、甘草、薄荷、黄芩、浙贝母、知母、牛蒡子、青蒿”，连花清瘟颗粒中“金银花、连翘、麻黄、石膏、苦杏仁、甘草、薄荷、板蓝根、贯众、鱼腥草、广藿香、大黄、红景天”，疏风解毒颗粒中“虎杖、连翘、板蓝根、柴胡、败酱草、马鞭草、芦根、甘草”为关键词，获取三方中药活性成分信息。并将毒药物动力学参数设置为口服生物利用度(oral bioavailability, OB)≥30%、类药性(drug likeness, DL)≥0.18进行筛选，获取三方中的主要活性成分群。

1.2 三方中活性化合物作用靶点和COVID-19疾病靶点的预测

通过TCMSP、DrugBank(https://www.drugbank.ca/)和Uniport(https://www.uniprot.org/)数据库，预测并筛选出符合1.1标准的作用靶点，并将其蛋白和基因信息标准化为相应基因简称。应用GeneCards(https://www.genecards.org/)数据库，以“novel coronavirus pneumonia”“viral pneumonia”为关键词检索COVID-19的相关靶点。随后运用Venny平台筛选出药物主要活性成分与疾病的共同靶点，得到三方治疗COVID-19的靶点。

1.3 三方治疗COVID-19共有靶标蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)及网络可视化的构建

将三方中活性化合物预测得到的靶点与COVID-19的疾病靶点相映射，分别得到三方与疾病的交集靶点。然后对三方的交集靶点进行分析得到共有的靶点，将其输入STRING数据库(https://string-db.org/)构建靶标PPI网络图，并将结果可视化。

1.4 三方治疗COVID-19“重要活性化合物-靶点”网络图

分别将得到的三方中的活性化合物、潜在作用靶点输入Cytoscape 3.7.2(http://www.cytoscape.org/)软件中，设置节点度值(Degree)≥20为标准进行筛选，构建“重要活性化合物-靶点”网络图。

1.5 靶点功能富集分析

使用DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)上传三方中中药对COVID-19作用的靶点基因名称，物种设置为“Homo sapiens”，经数据库检索和转化操作进行 GO富集(包括分子功能、生物过程和细胞成分)和 KEGG通路富集分析。

1.6 三方抗COVID-19疗效验证

中药抗COVID-19药效预测分析平台TCMATCOV(http://tcmatcov.bbtcml.com/)是由中国中医科学院中药研究所中药新药设计课题组和北京蛋白质组研究中心生物学网络课题组联合开发，用于预测单味中药及中药复方抗COVID-19疗效的平台。基于TCMATCOV平台，将蛋白质相互作用置信分数设置为0.5，阴性对照方剂选择半夏白术天麻汤，阳性对照选择化湿败毒颗粒，对三方抗COVID-19疾病网络进行稳健性分析。

2 对数据库检索结果进行分析

2.1 三方活性化合物的筛选

从TCMSP、BATMAN-TCM数据库平台检索到金花清感颗粒、连花清瘟颗粒、疏风解毒颗粒分别有1 817个、1 743个、1 151个化合物。经OB值和DL值筛选后得到主要活性化合物分别为209个、208个、179个，其中120个为三方共同主要活性化合物(图1)。

JHQGKL：金花消感颗粒；LHQWKL：连花清瘟颗粒；SFJDKL：疏风解毒颗粒。图1 三方活性化合物韦恩图

2.2 三方治疗COVID-19共有靶点相互作用核心网络图

根据TCMSP、Uniport数据库得到金花清感颗粒、连花清瘟颗粒、疏风解毒颗粒潜在作用靶点分别为139个、132个、129个。通过GeneCards数据库检索得到3 476个COVID-19的治疗靶点。运用Venny平台对三方相关治疗靶点取交集，其中金花清感颗粒治疗COVID-19靶点最多，为101个；其次是连花清瘟颗粒和疏风解毒颗粒，分别为94个和92个。再将三方治疗靶点取交集，共得到92个靶点(图2)。将三方中共有的靶点导入STRING平台构建PPI网络，再将得到的结果输入Cytoscape 3.7.2软件进行可视化。网络中(图3)共有92个节点(节点表示靶点)，937条边(边表示靶点之间的作用关系)，平均节点度值为20.4，节点大小代表度值高低，有35个靶点超过平均度值，聚类系数为0.596，网络中心势为0.423，将Degree前10个基因作为关键基因(表1)。

JHQGKL：金花消感颗粒；LHQWKL：连花清瘟颗粒；SFJDKL：疏风解毒颗粒。图2 三方治疗COVID-19靶点韦恩图

图3 三方治疗COVID-19共有靶点PPI网络图

表1 三方治疗COVID-19共有靶点PPI网络图中关键靶点

2.3 三方治疗COVID-19“重要活性化合物-靶点”图

运用Cytoscape 3.7.2软件以节点Degree≥20为筛选标准提取子网络，构建三方重要活性化合物与COVID-19疾病靶点网络图。在网络中，MOL000098(槲皮素)可作用于MAPK14、ACHE等多个靶点，ACHE靶点又能与槲皮素、MOL000422(山柰酚)等多个化合物相连。这反映了中药治疗疾病具有多重效应的特点[7]。通过“重要活性化合物-靶点”图比较发现，三方中以金花清感颗粒治疗COVID-19的重要活性化合物和作用靶点最多(化合物38个，靶点31个)，其次是连花清瘟颗粒(化合物33个，靶点30个)和疏风解毒颗粒(化合物24个，靶点30个)(图4～6)。

图4 金花清感颗粒“重要活性化合物-靶点”图

图5 连花清瘟颗粒“重要活性化合物-靶点”图

图6 疏风解毒颗粒“重要活性化合物-靶点”图

2.4 靶点通路分析

将靶点通过DAVID数据库进行GO功能富集分析，其中金花清感颗粒、连花清瘟颗粒、疏风解毒颗粒得到GO条目(P<0.05)依次为359个、348个和326个。KEGG通路富集筛选得到金花清感颗粒中符合条件的作用于COVID-19的通路有144条(P<0.05)，连花清瘟颗粒139条，疏风解毒颗粒140条。在靶基因富集最多的前10条通路中，三方均与PI3K-Akt、MAPK 、IL-17、TNF信号通路密切相关(图7～9)。

图7 金花清感颗粒治疗COVID-19的通路气泡图

图8 连花清瘟颗粒治疗COVID-19的通路气泡图

图9 疏风解毒颗粒治疗COVID-19的通路气泡图

2.5 三方对COVID-19治疗效果的预测

运用TCMATCOV V1.0平台对三方干扰COVID-19疾病网络稳定性进行评价分析，其中网络平均连接度为网络中所有节点连接度的平均值，数值越大则网络越稳定，负值说明药物对于疾病网络稳定破坏力强。网络平均最短路径为网络中所有最短路径长度的平均值，数值越小网络越稳定，正干扰率说明药物对于网络稳定性有破坏作用。连接度中心性和紧密度中心性分别由所有节点的连接度中心性和所有节点的紧密度中心性计算而来，因此这两个指标数值越大网络越稳定，其负扰动率越大则药物对于网络稳定破坏力越强。综合以上4个数值的扰动率总评分，从整体上评估了药物对于COVID-19疾病网络稳定性的干扰程度，其数值越高，则药物对于疾病网络稳定的破坏程度越高[8]。综合评价，金花清感颗粒、连花清瘟颗粒和疏风解毒颗粒扰动率总评分分别为18.05、21.60和20.84，与阳性对照组方剂化湿败毒颗粒临床疗效非常接近(表2)。

表2 药物干预疾病网络稳健性评价

3 讨论

目前认为本病的病因为感受“疫戾”之气，病位在肺、脾，病机核心为湿、毒。现代研究证明[9-11]，三方具有抗病毒、抗炎、解热和调节免疫的作用；同时三方对于治疗COVID-19、病毒性肺炎具有较好的临床疗效，能有效地改善患者发热、乏力、咳嗽、咳痰等临床症状[12-16]。金花清感颗粒、连花清瘟颗粒均由银翘散、麻杏石甘汤加减化裁而来，两方中均含有金银花、连翘、麻黄、石膏、苦杏仁、甘草、薄荷，具有清热解毒、辛凉宣肺之功；此外，金花清感颗粒含有的黄芩、浙贝母、知母、牛蒡子、青蒿可清热泻火、化痰利咽；连花清瘟颗粒含有的板蓝根、贯众、鱼腥草、广藿香、大黄、红景天可健脾化湿、活血通腑。疏风解毒颗粒中虎杖、败酱草、马鞭草清热利湿、散结消肿，连翘、板蓝根清热解毒，柴胡解肌退热，芦根生津防津液耗伤太过，甘草调和诸药，共奏疏风清热、解毒利咽之功。三方均具有疏散风热、清热解毒的功效，但目前对三方之间的共性和比较研究相对较少。

网络药理学研究结果显示，三方中含有共同化合物120个，共同治疗靶点92个。MOL000098(槲皮素)、MOL000422(山柰酚)、MOL000358(β-谷甾醇)和MOL000449(豆甾醇)在三方网络中度值高，可能是三方发挥治疗作用的重要共性化合物。将三方主要活性成分调控的靶点与COVID-19的治疗靶点取交集，度值排名前10的靶点有IL-6、MAPK3、VEGFA、JUN、EGF、EGFR、MAPK1、PTGS2、MAPK8、IL-1β。IL-6和IL-1β都是白细胞介素家族成员，属于细胞因子的一种，由免疫细胞所分泌，参与体内的免疫和炎症反应。当体内的免疫反应过度激活时，则会引起免疫激化，导致体内大量炎症因子过度表达，从而形成细胞因子风暴[17]。相关研究表明[18-19]，COVID-19患者的严重程度和细胞因子风暴密切相关，而IL-6在细胞因子风暴中发挥着重要作用。VEGFA、JUN、EGF、EGFR和PTGS2等都参与肺纤维化的病变过程。VEGF一方面能通过与血管内皮生长因子受体相结合介导血管的生成，为细胞外基质和胶原纤维的合成提供营养，从而加重纤维化；另一方面能激活VEGF/p-Junk信号通路，导致血管内皮细胞发生肿胀，影响肺的换气功能[20-21]。

通过富集分析发现，金花清感颗粒治疗COVID-19所涉及的分子机制最多，且与连花清瘟颗粒以及疏风解毒颗粒相比，其与PI3K-Akt及MAPK 信号通路关系最为密切。PI3K-Akt和MAPK是细胞内重要的信号通路，能调控细胞的生长、增殖、分化、黏附、侵袭和凋亡，对于治疗呼吸系统疾病、病毒感染具有重要作用[22-23]。据报道[24-25]，细胞内PI3K-Akt信号通路是病毒吞噬和复制所必需的，几乎所有DNA和RNA病毒都会对该通路进行调控，以调节病毒的活力，实现对宿主细胞的感染以及介导细胞转化。Akt是PI3K-Akt信号通路的关键分子，活化的Akt能激活下游信号分子，对细胞功能进行调控。一些PI3K或其下游信号Akt的抑制剂可以通过抑制细胞中PI3K和Akt蛋白的磷酸化，从而抑制PI3K-Akt信号通路的激活，阻断病毒的感染和复制。MAPK信号通路是有效的核蛋白复合体，为细胞核输出和合成病毒所必需，MAPK通路的抑制剂可以减少病毒复制和炎症症状[26-27]。

综上所述，本文通过网络药理学的方法对目前临床常用的早期治疗COVID-19的中成药进行了多层次分析，发现三方对COVID-19均有治疗作用。与连花清瘟颗粒和疏风解毒颗粒两方相比，金花清感颗粒重要活性化合物、靶点及作用通路更多，但三方疗效还需进一步临床观察与基础研究。同时由于对相关参数的设置筛选，导致本研究并未对COVID-19入侵研究较明确的靶点ACE2、CD147等进行探讨，但在一定程度上为临床三方的运用以及深入研究提供了思路。