牙周基础治疗对高原官兵龈沟液HNP1-3水平的影响

艾 林，李 恺，徐 娜，高 鹏，张若冰

(空军第九八六医院： 1口腔科， 2皮肤整形科，陕西 西安 710054； 3陕西省药品监督管理局，陕西 西安 710065)

慢性牙周炎是一种以牙周支持组织炎症性破坏为特征的疾病，破坏的严重程度取决于细菌的种类及数量、宿主对细菌感染先天免疫的遗传因素和环境因素之间的动态平衡。口腔菌群由口腔上皮细胞、唾液和龈沟液参与的免疫反应调控，蛋白质和抗菌肽也参与这种局部防御机制[1]。人类唾液和龈沟液含有多种抗菌肽，其结构上含有阳离子肽、酶和凝集蛋白，阳离子肽α-防御素人类中性粒细胞肽(human neutrophil peptide，HNP)是最具特征的抗菌分子，与多形核白细胞迁移有关。防御素参与宿主的免疫反应，能够杀死革兰阳性细菌、革兰阴性细菌、真菌和一些病毒[2]。此外，它们还可以刺激肥大细胞脱颗粒，调节补体激活，并增加巨噬细胞的吞噬功能，在预防和根除感染方面起着重要作用[3-4]。越来越多的证据表明，包括HNP1-3在内的抗菌肽具有免疫调节特性[5]。但HNP参与牙周组织免疫过程的机制尚不清楚，需要进一步的研究。

我国高原面积广阔，战略地位重要。在高原环境下，口腔疾病的患病率显著高于其他地区，严重影响官兵的健康和作战效率[6]。有研究表明，70%的官兵患有不同程度的牙周病[7]。本研究的目的是评估高原驻训官兵牙周基础治疗后牙周临床指数、龈沟液中HNP1-3水平以及口腔菌群的变化，从而了解牙周基础治疗对于高原驻训官兵牙周健康的影响。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择2019年4月至2019年11月在格尔木西大滩地区(4 400 m)驻训的无全身系统性疾病的官兵50名(均为男性)，年龄(25.5±6.2)岁。排除标准：影响牙周治疗的严重系统性疾病(心脑血管疾病、中风、糖尿病、呼吸道感染等)；治疗前6个月接受全身抗生素治疗；对硝唑类和/或青霉素类药物过敏。纳入条件：牙龈炎或轻、中度牙周炎(牙周袋≤6 mm，附着丧失≤4 mm，X线片显示牙槽骨水平型或角型吸收超过根长的1/3，但不超过根长的1/2。牙齿可能有轻度松动，多根牙的根分叉区可能有轻度病变，牙龈有炎症和探诊出血，也可有脓)；3个月内未做口腔治疗；不吸烟。受试官兵统一培训巴氏刷牙法。所有病例都被告知了这项研究，并提供了书面同意书。这项研究得到了空军第986医院伦理委员会的批准后实施(许可证号：20190037)。

1.2 主要材料与仪器

标准菌株(空军军医大学口腔内科学实验室，中国)；细菌基因组DNA提取试剂盒、引物(Sigma公司，美国)；菌斑染色剂、ELISA试剂盒(Gibco公司，美国)；Whatman滤纸(Whatman公司，英国)；UNC 15牙周探针、超声波洁牙机(Hu Friedy公司，美国)；LM超声波定标器(Parainen公司，芬兰)；Periotron 8000校准装置(Oraflow公司，美国)；酶联检测仪、自动凝胶成像分析仪(Nikon公司，日本)。

1.3 口腔检查与采集样本

在治疗前(基线检查)以及治疗后的3个月和7个月，使用相同类型的UNC 15牙周探针进行牙周检查，并记录探诊深度、牙龈退缩、菌斑指数和探诊出血、临床附着水平测量值。从颊侧近中、中部、远中，舌侧近中、中部、远中6个部位对采集的牙进行探诊深度、牙龈退缩、临床附着水平、探诊出血检测，在颊侧近中、中部、远中和舌侧4个标志点测定菌斑指数。口腔检查由同一名资深主治医师执行。

在基线检查、治疗3个月和7个月时分别收集龈沟液，并用相对Periotron单位测定龈沟液流速。用棉卷隔离牙齿，轻轻去除牙菌斑，并吹干牙齿。将Whatman滤纸放置在牙周袋中1～2 mm深度处静置30 s，如血液污染则丢弃滤纸。使用Periotron 8000校准装置测量纸条上吸收的龈沟液体积并称质量。测量后，立即将样品置于含有20 μL PBS的Eppendorf试管中，并于-70 ℃冰箱冷冻。

1.4 牙周基础治疗及复查

由一名资深主治医师使用LM超声波定标器和超声波洁牙机进行全面的口腔卫生指导、龈上洁治、龈下刮治和抛光，必要时1周后进行根面平整。口腔卫生指导如下：每日饭后使用牙线或/和牙间隙刷，每日至少刷牙2次。

1.5 测定HNP1-3含量

根据ELISA生产商的说明书，使用试剂盒测定龈沟液中HNP1-3的浓度。HNP1-3的最低检出量为0.156 μg/L。

1.6 牙周致病菌的检测

驻训结束后使用无菌刮匙刮取受试官兵下颌切牙龈袋底的龈下菌斑，放入EP管内，加入0.01 mol/L PBS高速离心(10 000 r/min)10 min后，弃上清提取沉淀DNA。自行设计、合成引物，采取PCR技术对龈下菌斑DNA进行扩增，以5种标准菌株：牙龈卟啉单孢菌、福赛氏类杆菌、中间普氏菌、齿垢密螺旋体和伴放线放线杆菌为阳性对照，以变异链球菌(ATCC 27607)为阴性对照，在琼脂糖凝胶电泳后于紫外线检测仪下观察扩增带。

1.7 统计学分析

使用SPSS 21.0软件进行统计分析。正态性分布采用Kolmogorov-Smirnov检验，非正态性分布采用不等距重复测量的方差分析。采用Spearman秩和检验分析每个测量点HNP1-3含量与牙周临床指数、沟液流速的相关性。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 牙周临床指数变化

牙周基础治疗使样本在不同采集时间点的临床评估指数(探诊深度、临床附着水平、菌斑指数、龈沟液流速)有统计学意义的改善(P<0.01)，而探诊出血的变化没有统计学意义(表1)。

表1 不同采样时间点牙周临床指数变化

bP<0.01vs基线。

2.2 HNP1-3水平变化

HNP1-3基线值[(99±11)ng]与治疗3个月[(139±15)ng]和7个月[(145±18)ng]时的测量值比较存在统计学差异(P<0.05)，3个月和7个月时比较无统计学意义(P>0.05)。龈沟液量基线值[(4.3±0.6)μg]与治疗3个月[(2.6±0.4)μg]和7个月[(2.1±0.6)μg]时的测量值比较存在统计学差异(P<0.01)，3个月和7个月时比较无统计学意义(P>0.05)。

对HNP1-3、龈沟液流速、探诊深度和临床附着水平之间的相关性检验结果显示：7个月后，临床附着水平与龈沟液流速呈强正相关(r=0.519)；探诊深度与龈沟液流速呈正相关(r=0.462)；HNP1-3水平与临床附着水平呈负相关(r=-0.473)。

2.3 五种牙周致病菌的检出情况变化

五种牙周致病菌在官兵治疗7个月时检出率明显低于基线(P<0.05，表2)。

表2 五种牙周致病菌的检出情况变化 [n(%)]

3 讨论

高原环境下，口腔疾病的患病率明显高于其他地区，对驻训官兵开展积极的口腔疾病预防工作有着重大战略意义。牙周病是导致成人牙齿丧失的主要原因，严重影响口腔健康。并且在日常训练、执行任务及战斗时，牙周病带来的口腔问题，严重影响官兵的生活质量，会大大削弱官兵的战斗力。因此，对于口腔健康保障维护方法的研究，对我军一线部队显得尤为重要。

口腔是一个复杂的微生物环境，大约包含700种不同的细菌，其中一部分与人体构成共生菌群，而另一些则具有潜在致病性。菌群由口腔上皮细胞、唾液和龈沟液的先天免疫反应控制，此外蛋白质和抗菌肽也参与这种局部防御机制[8]。阳离子肽、酶和大的凝集蛋白是保护口腔内环境必不可少的物质，阳离子肽包括肾上腺髓质素、α-防御素、β-防御素、组织蛋白酶、天青酸、降钙素相关肽、神经肽Y、物质P和血管活性肠肽[9]。而防御素是最具特征的抗菌分子，但其在免疫机制中的作用尚未明确。α-防御素(HNP1-4)位于中性粒细胞的嗜天青颗粒中，而HNP5-6则存在于肠潘氏细胞中[10-11]。α-防御素在口腔中存在于唾液腺、唾液以及龈沟液中，与多形核白细胞迁移有关。

防御素参与宿主的先天免疫，能够杀死革兰细菌、真菌和一些病毒，通过CD4+T细胞和未成熟树突状细胞诱导先天性和获得性免疫反应，并且刺激肥大细胞脱颗粒，激活补体系统，增加巨噬细胞的吞噬功能[12]。然而，它们在人体免疫中的作用尚未完全阐明。有研究表明[13]，HNP1-3抗菌肽具有免疫调节特性，但其参与牙周组织先天性和获得性免疫的机制需要进一步的研究。

HNP占中性粒细胞总蛋白质含量的5%～7%，杀菌作用与细胞膜中通道的形成以及细菌的半透性变化相关，这种非特异性的作用可以导致自身细胞的破坏，是中性粒细胞介导的组织破坏机制的一部分[14]。HNP1能刺激角质形成细胞的增殖、附着和扩散，而高剂量则会增加细菌附着和角质形成细胞的死亡。HNP还具有免疫调节特性[15]。此外，在高浓度下，它们对肿瘤和真核细胞具有细胞毒性，会造成DNA损伤和肿瘤细胞溶解[16]。细菌感染可增强口腔炎症患者的唾液中α-防御素的表达[11]。

本研究结果显示，官兵在基线、术后3个月和7个月时，龈沟液中HNP1-3的含量水平增加。HNP1-3水平升高与收集部位的龈沟液体积增大无关，因为治疗会导致炎症消退、龈沟液流速降低。

牙周治疗后HNP1-3水平的升高可能与龈沟部位的特殊生物学特性有关，在健康状态下，牙龈结缔组织中不存在炎性细胞，而龈沟中含有中性粒细胞，这些中性粒细胞会随着菌群的变化而从组织中迁移，牙周治疗后HNP水平升高的另一个原因是牙周病变的消除。防御素是某些细菌蛋白酶的底物，牙龈能够对部分抗菌肽和较低水平的HNP1-3进行蛋白水解分解[17]。另一方面，在本研究表明抗菌肽浓度越高，聚集程度越大，推测在治疗前由于HNP聚集，ELISA法不能有效地测定高浓度的HNP1-3；另一个原因可能是抗菌肽与细菌脂多糖和DNA的结合，使HNP在样品初始离心后留在颗粒中。

龈沟液体积增大表明炎症严重程度增加，牙龈炎的早期症状之一是龈沟液流速的增加和出血倾向的增加。本研究中，所有的龈沟液样本都是在同一时间段内收集的，数据以每个测量点的总量表示。这是因为在炎症活跃的情况下，液体体积的增加可能导致研究分子稀释值(仅局部存在)的错误读数，或当其同时在外周血中表达时，其浓度升高[18]。

传统牙周治疗的局限性促使人们寻找新的更好的治疗方式。抗菌肽是一种天然免疫成分，它能有效地对抗牙周病原菌，而不会对宿主细胞产生毒性作用，可以有效地预防和治疗牙周炎。然而，人们对其作用的认识仍然非常有限，迄今为止发现的数百种抗菌肽中没有一种对牙周治疗有临床意义。本研究选取五种公认的牙周可疑致病菌，采用聚合酶链式反应法进行厌氧菌检测，结果表明牙周基础治疗能够降低牙周致病菌的检出率。

综上所述，本研究中官兵龈沟液中HNP1-3的总量增加，但仍需要进一步研究来充分阐明HNP1-3在牙周病中的作用，为提高部队战斗力、全面提升医疗保障能力提供重要补充。