惰性气体微泡联合低频低强度超声辐照对人胰腺癌PANC-1细胞抑癌作用的实验研究

金婷婷 蒋天安 郑树森 王利英

胰腺癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率呈逐年上升趋势，其致病因素目前尚未完全明确，患者临床症状隐匿不典型，恶性程度和侵袭性高，加之其表达多种耐药基因，对放疗、化疗均不敏感，预后极差，确诊后5 年生存率仅10%，严重威胁患者身体健康和生命［1］。加强胰腺癌分子机制研究，提高治疗效果，延长患者生存时间，是目前亟待解决的问题。肿瘤的发生和发展是细胞凋亡与细胞增殖间动态平衡被破坏的结果，除放疗、化疗和手术治疗外，诱导细胞死亡已成为目前抗肿瘤治疗的研究热点。随着超声生物学效应的深入研究，超声治疗作为非侵入性的肿瘤治疗方法表现出良好的应用前景。低频低强度超声指频率20 kHz～1 MHz、声强＜3 W/cm2的超声波。近年来低频低强度超声辐照联合微泡造影剂在诱导肿瘤细胞凋亡、改变细胞通透性、开放生物屏障等方面取得了较好的成就，在肿瘤治疗上显示了较好的潜力［2-3］。本实验旨在探讨惰性气体微泡联合低频低强度超声连续辐照对人胰腺癌PANC-1细胞的抑癌作用，为肿瘤治疗提供新的研究思路。

材料与方法

一、主要实验材料及仪器

1.主要实验材料：人胰腺癌PANC-1 细胞株（中国科学院上海细胞与生物研究所细胞资源中心提供）。SonoVue 造影剂（意大利Bracco 公司），为六氟化硫微泡冻干粉，直径为2～5 μm；0.9%氯化钠溶液；特级胎牛血清（法国Biowest 公司）；RPMI 1640 液体培养基（美国Hyclone 公司），规格SH30809.01，含L-谷氨酰胺，不含硝酸钙；0.25%胰蛋白酶（美国Gibco 公司）；CCK-8 试剂盒（日本同仁化学研究所）；Annexin VFITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（美国BD公司）。

2.主要仪器：超声波治疗仪（ME740，梅特勒电子股份有限公司），由主机、超声探头、可拆卸的医用电源、供电电池组和连接线组成，探头直径13 mm，头端呈平面圆形；分析型流式细胞仪（FACSCanto Ⅱ，美国BD公司）。

二、实验方法

1.细胞培养：先于37.0℃、5%二氧化碳湿化培养箱中将人胰腺癌PANC-1细胞用含15%特级胎牛血清的RPMI 1640 液体培养基培养，每2～3 d 传代1 次。再用0.25%胰蛋白酶将对数生长期的人胰腺癌PANC-1细胞消化，收集细胞悬液，1200 r/min 离心3 min，弃上清液，得到浓度为1×106/ml 的人胰腺癌PANC-1 单细胞悬液。

2.分组及处理方法：按处理方法不同分为4 组。①空白对照组：于试管内直接加入人胰腺癌PANC-1单细胞悬液2.0 ml；②惰性气体微泡组：用5.4 ml 0.9%氯化钠溶液稀释SonoVue，充分振荡摇匀，制成混悬液备用；于试管内加入1600 μl人胰腺癌PANC-1单细胞悬液和400 μl制备好的SonoVue 混悬液，充分混匀，使微泡浓度达到20%；③低频低强度超声组：于试管内加入2.0 ml 人胰腺癌PANC-1 单细胞悬液，试管底部均匀涂上超声耦合剂，置于超声探头上，应用低频低强度（1 MHz、0.60 W/cm2）超声波连续辐照60 s；④微泡+超声组：于试管内加入1600 μl 人胰腺癌PANC-1单细胞悬液和400 μl SonoVue 混悬液，充分混匀，使微泡浓度达到20%；然后在试管底部均匀涂上超声耦合剂，置于超声探头上，应用低频低强度（1 MHz、0.60 W/cm2）超声波连续辐照60 s。

3.检测细胞增殖活性：将已处理好的细胞接种到96孔板中，每孔约100 μl细胞悬液，置于37.0℃、5%二氧化碳培养箱内预培养24 h。每孔分别加入10 μl 细胞计数试剂，轻拍培养板去除气泡，使其均匀混合，于培养箱中孵育3 h 后，应用双波长法测定波长450 nm处的吸光度值（设定450～490 nm 为检测波长，600～650 nm 为参考波长）。细胞增殖活性以吸光度值表示。同一样本重复测量5次取平均值。

4.检测细胞凋亡情况：将每组人胰腺癌PANC-1细胞浓度调整为1×106/ml，于4℃、1000 r/min、离心半径15 cm 的离心机中离心5 min，弃上清液，将细胞重悬于200 μl结合缓冲液中，加入5 μl Annexin V 和5 μl PI混合，避光室温下反应15 min，然后应用分析型流式细胞仪分析各组细胞凋亡率。同一样本重复测量5次取平均值。

三、统计学处理

应用SPSS 10.0 统计软件，计量资料以±s表示，多组比较采用SNK 多重比较法，两两比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

一、各组人胰腺癌PANC-1细胞增殖活性比较

空白对照组、惰性气体微泡组、低频低强度超声组、微泡+超声组人胰腺癌PANC-1 细胞增殖活性分别为0.9356±0.1652、1.1126±0.0738、0.3236±0.0126、0.1566±0.0137，多组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。其中微泡+超声组细胞增殖活性均低于其余各组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

二、各组人胰腺癌PANC-1细胞凋亡率比较

空白对照组、惰性气体微泡组、低频低强度超声组、微泡+超声组人胰腺癌PANC-1细胞凋亡率分别为0.069±0.007、0.033±0.006、0.279±0.016、0.678±0.018，多组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。其中微泡+超声组细胞凋亡率均高于其余各组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见图1。

图1 各组人胰腺癌PANC-1细胞凋亡率分析图

讨论

肿瘤学认为，肿瘤细胞增殖失控和死亡抑制是肿瘤发生的主要原因，肿瘤细胞的死亡方式包括坏死、自噬和凋亡［4-5］。其中凋亡被称为Ⅰ型程序性细胞死亡；自噬被称为Ⅱ型程序性细胞死亡，是广泛存在于真核细胞内的一种溶酶体依赖的降解途径。肿瘤细胞自噬的作用广泛，在肿瘤生长发育和迁移等方面具有重要作用［5］。研究［6］报道当细胞自噬活性超出正常水平时可转变为一种对抗细胞癌变的机制，过度自噬导致的细胞自噬性死亡可杀灭肿瘤细胞，从而达到抑癌效应。超声波可以杀灭肿瘤细胞，破坏肿瘤组织和间质，抑制肿瘤细胞增殖，主要机制为机械效应、热效应及空化效应；其中空化效应指超声波在液体中传播时，通过空化核震荡、膨胀、收缩、崩溃等一系列动力学过程，产生的休克波使肿瘤细胞膜通透性增加，微血管破裂，内皮细胞间隙增大，并介导血管内皮层破坏，导致血管内微血栓形成，阻断恶性肿瘤组织的血供［7］。目前超声治疗作为一种安全、无创、无辐射的治疗方式已广泛应用于肿瘤治疗。超声造影剂的微气泡可增强超声波的空化效应，近年来其在肿瘤治疗领域的研究有一定进展。研究［8］报道超声造影剂在抗肿瘤血管作用、血脑屏障和血脊髓屏障开放、免疫疗法、诱导肿瘤细胞死亡、基因靶向治疗、药物输送等方面均有积极作用。目前最新的第二代超声造影剂主要有以SonoVue 为代表的包裹惰性气体的脂质体，直径2～5 μm，不溶于水，稳定性较好，在基础实验和临床研究中最为常用。

研究［9］报道微泡造影剂联合低频低强度超声辐照可引起细胞膜和细胞内结构破坏、核内染色体中双螺旋DNA 和基因片段断裂，导致前列腺癌细胞、肝癌细胞、人白血病细胞等多种癌细胞死亡，具有明显的抑制癌细胞生长的作用，同时又可减少对正常组织和细胞的损伤。Hou等［10］报道微泡造影剂联合低频超声可影响肿瘤细胞的低氧反应，诱导细胞凋亡，抑制增殖，促进肿瘤细胞死亡。Yang 等［11］报道低频超声联合微泡造影剂可促使肿瘤细胞凋亡加快，减少细胞增殖，抑制肿瘤生长和血管生成，使肿瘤迁移和侵袭能力明显减弱。本实验将惰性气体微泡与低频低强度超声联合作用于人胰腺癌PANC-1细胞，结果发现微泡+超声组细胞增殖活性均低于其余各组，细胞凋亡率均高于其余各组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），表明惰性气体微泡联合低频低强度超声可使人胰腺癌PANC-1细胞增殖活性大大减低，同时可诱导人胰腺癌PANC-1细胞凋亡。

既往文献［12-13］报道惰性气体微泡联合低频低强度超声引起的癌细胞死亡与超声波频率、声强、辐照时间及微泡浓度均密切相关，即随着超声波频率增加，其空化作用增强，空化阈值降低，癌细胞凋亡增加；随着超声波声强升高、微泡与肿瘤单细胞悬液体积比增加及超声连续辐照时间延长，使癌细胞凋亡增加。张蔚等［13］通过重复正交试验发现，微泡与肿瘤单细胞悬液体积比达到20%时可明显诱导肿瘤细胞凋亡，降低肿瘤细胞存活率，从而抑制肿瘤组织增殖、活化及浸润，发挥抗癌作用。本实验因条件有限，未进行重复正交试验，故未获得增加人胰腺癌PANC-1细胞整体凋亡率、抑制肿瘤组织增殖及活化的超声波频率、声强、辐照时间及微泡浓度的相应阈值。本课题组下一步将争取条件实现重复正交试验，获得上述参数的阈值，并建立兔VX2 胰腺癌模型，探讨惰性气体微泡联合低频低强度超声连续辐照对胰腺癌动物模型的抑癌效果。

综上所述，惰性气体微泡联合低频低强度超声辐照能降低体外人胰腺癌PANC-1 细胞增殖活性，诱导细胞凋亡，具有明显的抑癌作用，为临床肿瘤治疗提供了新的研究思路。