猫STR 基因座复合扩增体系的构建及其法医学应用

席世涵，屈轶龄，夏若成，熊磊，4，柴思雨，5，佟春兰，陶瑞旸，李成涛

1.内蒙古民族大学临床医学院，内蒙古 通辽 028000；2.司法鉴定科学研究院 上海市法医学重点实验室司法部司法鉴定重点实验室 上海市司法鉴定专业技术服务平台，上海 200063；3.苏州大学医学部法医学系，江苏 苏州 215123；4.内蒙古医科大学基础医学院法医学系，内蒙古 呼和浩特 010030；5.遵义医科大学基础医学院，贵州 遵义563000

随着居民生活水平的提高，宠物逐渐成为家庭中的重要组成部分，随之而来的涉及宠物的盗窃案件、宠物伤人案件、流浪动物管理和非法饲养野生动物等社会问题也层出不穷。根据《2020 年中国宠物行业白皮书》（www.pethadoop.com），2020 年我国城镇犬猫总数已突破1 亿只，其中城镇宠物猫数量已达4 862 万只，同比2019 年增长了10.2%。因此，建立准确有效的方法对猫进行种属鉴定、个体识别和亲缘关系鉴定已然成为司法鉴定行业的迫切需求。

以往针对猫的个体识别主要基于葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD）、苹果酸酶（malic enzyme，ME）和酯酶D（esterase D，ESD）等生物化学标记的多态性[1-3]，但受个体发育状况和实验条件等限制，应用十分有限。短串联重复序列（short tandem repeat，STR）是以2～6 个碱基对为核心单位串联重复形成的一类具有长度多态性的DNA序列，是目前法庭科学领域应用最广泛的遗传标记[4]。司法鉴定中主要应用聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）和毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）技术检测STR 遗传标记进行人类个体识别和亲缘关系鉴定，此方法在非人源DNA 鉴定案件中也有广泛的研究和应用，展现出良好的应用前景[5-7]。

MENOTTI-RAYMOND 等[8]于2005年初步构建了包含11个STR基因座和1 个Y 染色体性别决定区（sex determining region of Y，SRY）的猫复合扩增体系，随后COOMBER 等[9]对该体系的种属特异性、灵敏度及组织同一性进行了验证，证实了STR 基因座在猫的种属鉴定中的可行性。但由于当时尚未建立司法鉴定行业标准体系，位点筛选和方法建立均缺乏科学指导，因此，该体系包含的基因座数目较少，且在法医群体遗传学调查中仅计算了匹配概率（probability of matching，Pm）、期望杂合度（expected heterozygosity，He）和等位基因频率（allele frequency，AF），缺少累积个体识别率（total discrimination power，TDP）和累积非父排除率（cumulative probability of exclusion，CPE），未对体系的整体系统效能作出评价。

综上，本研究以MENOTTI-RAYMOND 等[8]的研究为基础，根据《司法鉴定行业标准体系》（SF/T 0061—2020）的指导，筛选16 个四碱基重复的猫常染色体STR 基因座和1 个SRY，尝试构建适用于猫的STR 基因座复合扩增体系，并根据DNA 分析方法科学工作组（Scientific Working Group on DNA Analysis Methods，SWGDAM）的要求[10]对该体系进行种属特异性、灵敏度、稳定性、准确性、组织同一性和均衡性等方面的法医学验证，拟对其涉及猫的个体识别和亲缘关系鉴定的检测效能和应用价值进行评估。

1 材料与方法

1.1 样本收集与处理

本研究共采集145 例猫无关个体的样本（包含口腔拭子和静脉血），其中67 例猫口腔拭子采自内蒙古通辽农村，77 例猫静脉血样本采自上海和深圳两地的宠物医院，1 例猫口腔拭子、静脉血以及毛发样本采自上海的宠物医院。其中雄性80只，雌性65只。对上述口腔拭子、静脉血和毛发检材分别使用口腔拭子基因组DNA 提取试剂盒（上海凡济生物科技有限公司）、血液基因组DNA 提取试剂盒（上海凡济生物科技有限公司）和QIAamp®DNA Investigator 试剂盒（德国Qiagen 公司）抽提DNA，具体操作参照试剂盒说明书。使用QubitTMdsDNA HS Assay 试剂盒和QubitTM2.0荧光定量仪（美国Thermo Fisher Scientific 公司）对DNA 进行定量，并将DNA 稀释至1 ng/μL 备用。

本研究所用的人、猴、犬、猪、牛、羊、鸡、鸭、鼠、兔、驴、蛇12 种常见动物种属DNA 为实验室现存样本。本研究已通过司法鉴定科学研究院伦理委员会批准。

1.2 基因座筛选及引物设计

对文献[8-9，11-15]中已发表的猫STR 基因座数据资料进行整理和分析，筛选可用于猫个体识别和亲缘关系鉴定的STR 基因座。筛选条件：（1）等位基因长度在500 bp 以下；（2）重复单位为四核苷酸；（3）等位基因数大于6 个；（4）基因座杂合度大于0.5；（5）位于不同染色体上，互不存在连锁关系。

使用Primer Premier 5.0 软件（加拿大Premier 公司）对筛选出的基因座进行引物设计，要求所有引物的退火温度尽可能接近，且目标片段的大小呈梯度排列，使用引物设计和特异性检验工具（Primer-BLAST）检查引物与其他物种基因组序列是否存在非特异性杂交。经琼脂糖凝胶电泳确认引物可扩增出特异性条带后，采用FAM、HEX、TAMAR、ROX 作为荧光标签对引物进行荧光标记。本研究所涉及引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 PCR 反应条件

采用Multiplex PCR 试剂盒（德国Qiagen 公司）进行复合扩增，并对复合扩增体系的引物浓度、循环参数、DNA 模板量、退火温度、扩增体积等PCR 反应条件进行优化，使各基因座扩增产物基本达到平衡、特异的要求。具体操作：（1）反复调试各基因座引物浓度，以优化该复合扩增体系；（2）测试该复合扩增体系在53、55、57、59 ℃这4 个退火温度下的扩增情况，以优化该复合扩增体系的退火温度；（3）测试该复合扩增体系在26、28、30 这3 个循环数下的扩增情况，以优化该复合扩增体系的循环数；（4）测试该复合扩增体系在10、15、20 μL 这3 个扩增体积下的扩增情况，以优化该复合扩增体系的扩增体积。

1.4 电泳及STR 分型

取1 μL PCR 产物与9 μL 高度去离子甲酰胺（美国Thermo Fisher Scientific 公司）、0.4 μL ORG-500 分子量内标［基点认知技术（北京）有限公司］混匀，使用3130xl基因分析仪（美国Thermo Fisher Scientific 公司）对扩增产物进行毛细管电泳，应用GeneMapperTMIDv3.2 软件（美国Thermo Fisher Scientific 公司）对电泳结果进行分析。

1.5 复合扩增体系的法医学验证

1.5.1 种属特异性检验

取1 ng 人类DNA 标准品（9947A、9948）和11 种常见动物种属（猴、犬、猪、牛、羊、鸡、鸭、鼠、兔、驴、蛇）的DNA 样本，应用该体系进行复合扩增和电泳分离，验证其种属特异性，每个样本重复检测3 次。

1.5.2 灵敏度检验

使用QubitTM2.0 荧光定量仪对猫DNA 样本进行定量后，以2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5 ng 的DNA 模板量进行灵敏度验证，每个样本重复检测3 次。

1.5.3 稳定性检验

在含有1 ng DNA 样本的反应体系中分别加入1 μL 不同浓度的4 种常见PCR 抑制剂（血红素、腐殖酸、靛蓝、黑色素）。血红素浓度为100、200、300、500、700、800 μmol/L，腐殖酸质量浓度为50、100、150、200、250、300 ng/μL，靛蓝质量浓度为4 000、5 000、6 000、7 000、8 000、9 000 ng/μL，黑色素质量浓度为300、400、500、600、700、1 000 ng/μL。每个浓度重复检测3 次。

1.5.4 准确性检验

随机选取12 例猫无关个体DNA 样本，经该体系扩增后，进行16 次平行电泳检测，对其所有等位基因的电泳片段长度进行统计，计算各等位基因片段长度的平均值与标准差。

1.5.5 可重复性检验

随机选取10 例猫无关个体DNA 样本，由不同实验人员在两个实验室分别应用该扩增体系在不同的PCR 仪和基因分析仪上进行扩增和电泳分离，对比两次实验的分型结果。

1.5.6 组织同一性检验

取同一只猫的静脉血、口腔拭子以及毛发DNA样本进行PCR 扩增及电泳分离，通过对比同一个体不同组织的分型结果来验证该复合扩增体系的组织同一性。

1.5.7 均衡性检验

随机选取20例猫无关个体DNA样本，采用ZHANG等[16]描述的方法计算各基因座的杂合子等位基因均衡性、同一荧光标记下各基因座间的均衡性及不同荧光间的均衡性。杂合子等位基因均衡性：基因型为杂合子的基因座，用低峰峰值除以高峰峰值。同一荧光标记下各基因座间的均衡性：将同一荧光标记下各基因座中纯合子峰值除以2，杂合子峰值取平均数，用最小值除以最大值。不同荧光标记间的均衡性：分别计算同一荧光标记下所有基因座峰值的平均数，用最小值除以最大值。

1.5.8 混合样本检验

选取雄、雌性猫DNA 样本各1 例，使用QubitTM2.0荧光定量仪对DNA 进行定量后，将DNA 样本均稀释至1 ng/μL，将两者以1∶19、1∶9、1∶3、1∶1、3∶1、9∶1、19∶1的体积比配制混合样本，每份混合样本取1 μL，每个样本重复检测3 次，记录混合样本中次要贡献者的等位基因检出率。

1.6 群体遗传学调查

对145 例猫无关个体样本进行群体遗传学调查，应用Power Stats v1.2 软件（美国Promega 公司）计算16 个常染色体STR 基因座的等位基因频率、观察杂合度（observed heterozygosity，Ho）、个体识别率（discrimination power，DP）、非父排除率（probability of exclusion，PE）、Pm、多态信息含量（polymorphism information content，PIC）、CPE、TDP 和累积匹配概率（cumulative probability of matching，CPm）。CPE、TDP、CPm 的计算公式[4]如下：CPE=1-（1-PE1）（1-PE2）…（1-PEn），TDP=1-（1-DP1）（1-DP2）…（1-DPn），CPm=Pm1×Pm2…Pmn。

2 结果

2.1 复合扩增体系的建立

本研究共筛选出16 个猫常染色体STR 基因座（FCA733、FCA391、FCA740、F27、FCA453、FCA734、F85、F124、FCA742、FCA736、FCA730、FCA749、FCA559、FCA723、FCA441、FCA732）和1 个SRY。

经反复调试各基因座的引物浓度，使各基因座扩增产物达到平衡、特异的要求，各基因座详细信息见表1。

表1 猫复合扩增体系中16 个STR 基因座和1 个SRY 的基本信息Tab.1 The basic information of 16 STRs and a SRY in the Felis catus multiplex amplification system

将该复合扩增体系在53、55、57、59 ℃这4 个退火温度下的扩增产物分别进行毛细管电泳。当退火温度为53 ℃时，在基因座FCA740、FCA730、FCA559和FCA441出现非特异性扩增峰；当退火温度为55 ℃时，DNA 图谱整体均衡，无非特异性扩增峰；当退火温度为57 ℃时，基因座FCA734、F85扩增效率较55 ℃低；当退火温度为59 ℃时，基因座FCA740扩增图谱有渗透峰产生，FCA733、FCA391扩增效率低。根据上述结果，本研究选择的最佳退火温度为55 ℃。

将该复合扩增体系在26、28、30 个循环数下的扩增产物分别进行毛细管电泳。当循环数为26 时，基因座FCA734扩增效率低；当循环数为28 时，各基因座间峰值均衡，无非特异性扩增产物；当循环数为30时，基因座FCA734、FCA441扩增效率较低，FCA740出现渗透峰现象。根据上述结果，本研究选择的最佳循环数为28。

将该复合扩增体系在10、15、20 μL 这3 个扩增体积下的扩增产物分别进行毛细管电泳。当扩增体积为10 μL 时，基因座FCA559、FCA723、FCA441扩增效率低；当扩增体积为15 μL 时，各基因座间峰值均衡，无非特异性扩增产物；当扩增体积为20 μL 时，基因座FCA740出现渗透峰现象。根据上述结果，本研究选择的最佳扩增体积为15 μL。

通过优化实验确定PCR反应最佳的复合扩增体积为15 μL，包含7.5 μL Master Mix、1.5 μL Q-Solution、1 μL 荧光引物混合物和5 μL 模板DNA 及去离子水。PCR 反应的最佳退火温度为55 ℃，PCR 最佳循环数为28。PCR 循环条件为：95 ℃15 min；94 ℃30 s，55 ℃90 s，72 ℃90 s，28 个循环；60 ℃60 min；4 ℃保温。最终获得毛细管电泳分型结果（图1），可见峰型良好，无杂峰，各基因座峰高基本平衡。

图1 猫STR 基因座复合扩增体系的毛细管电泳图谱Fig.1 Capillary electrophoretogram of the multiplex amplification system of STR loci in Felis catus

2.2 种属特异性检验结果

采用该复合扩增体系对人类DNA 标准品9947A、9948 以及猴、犬、猪、牛、羊、鸡、鸭、鼠、兔、驴、蛇11 种其他常见动物种属的DNA 样本进行扩增和电泳分离，结果显示，除鸡DNA 样本在TAMRA 荧光116 bp处出现非特异性峰外，其他动物样本均未检出扩增产物。

2.3 灵敏度检验结果

对不同模板量的DNA 样本进行扩增与电泳分离，结果显示，随着DNA 模板量的减少，等位基因峰高逐渐降低（图2）。当DNA 模板量为0.25～2 ng 时，16 个常染色体STR 基因座均可得到完整分型，平均峰高为173～4 449 RFU。当DNA 模板量低至0.125 ng时，开始出现等位基因丢失现象，平均等位基因检出率为80.39%。当DNA 模板量高至2 ng 时，虽然所有等位基因均获得完整分型，但出现渗透峰现象。因此推荐的DNA 模板量为0.25～1 ng。

图2 灵敏度检验结果Fig.2 Sensitivity test results

2.4 稳定性检验结果

本研究构建的复合扩增体系对不同种类及不同浓度的PCR抑制物均有一定的耐受性。当体系中血红素浓度≤200 μmol/L、腐殖酸质量浓度≤100 ng/μL、靛蓝质量浓度≤6 000 ng/μL、黑色素质量浓度≤400 ng/μL时，均可得到准确分型且图谱清晰可靠。

2.5 准确性检验结果

12 例猫无关个体DNA 样本各等位基因片段长度在不同泳道中的标准差见图3，大部分等位基因在16 次平行检测中偏移不超过0.2 bp。随着片段长度的增加，片段迁移率有增大的趋势，但仍在0.3 bp 范围内。

图3 等位基因片段准确性检验Fig.3 Accuracy test of the allele fragments

2.6 可重复性与组织同一性检验结果

不同实验人员在不同实验室对同一样本进行扩增及电泳分离，获得的分型结果完全相同，峰高和产物长度基本一致。

同一只猫的静脉血、口腔拭子、毛发DNA 样本经扩增及电泳分离，获得的分型结果完全一致。

2.7 均衡性检验结果

随机选取的20 例猫无关个体样本的检测结果显示，该复合扩增体系的杂合子等位基因均衡性≥0.83，同一荧光标记的各基因座间峰高均衡性≥0.59，不同荧光标记间的峰高均衡性≥0.31。

2.8 混合样本检验结果

随着混合比例的不断增大，次要贡献者的检出率逐渐降低。雄、雌性猫样本在3∶1、1∶1、1∶3 的混合比例下均可获得完整的等位基因分型结果；当混合样本比例为1∶9、9∶1 时，次要贡献者的部分等位基因丢失，等位基因检出率均可达到81.4%；当混合比例进一步提高至1∶19 和19∶1 时，次要贡献者的等位基因检出率为59.2%、51.8%。

2.9 群体遗传学调查结果

本研究对145 例猫无关个体样本在16 个常染色体STR 基因座的等位基因频率和等位基因分布进行了调查。其中，138 例在16 个STR 基因座上均表现出完整的等位基因分型，有7 例在FCA736基因座未获得基因分型结果，等位基因频率见表2。在145 例猫无关个体样本中共观察到259 个等位基因，等位基因频率分布在0.003～0.397，其中多态性最高的基因座为F85，共有45 个等位基因。

表2 猫16 个常染色体STR 基因座的等位基因分布Tab.2 Alleles distribution of 16 autosomal STR loci in Felis catus（n=145）

续表2Continued Tab.2

各基因座的群体遗传学参数见表3，Ho 分布在0.531（FCA391、FCA732）至0.876（F85），平均为0.687；PIC分布在0.664（FCA441）至0.952（F85），平均为0.790；Pm 分布在0.012（F85）至0.133（FCA732），平均为0.034。16 个基因座的DP≥0.867（FCA732），PE≥0.216（FCA391、FCA732），均显示出良好的法医学应用潜能。该复合扩增体系的TDP 为1-3.57×10-20，CPE为1-6.35×10-5，CPm 为3.61×10-20。

表3 猫16 个常染色体STR 基因座的群体遗传学参数Tab.3 The population genetic parameters of 16 autosomal STR loci in Felis catus（n=145）

3 讨论

构建猫STR 基因座复合扩增体系对日益增多的涉及猫类的司法鉴定案件具有举足轻重的作用。STR基因座的选择在亲缘关系鉴定中尤为重要，其PIC、Ho、DP 和PE 等群体遗传学参数与复合扩增体系的整体效能密不可分，因此，在筛选STR 基因座时应选择等位基因数目较多、基因座广泛分布在各个染色体上、片段大小及间隔合理、扩增效能大致相同且互相不发生连锁反应的基因座。本研究在MENOTTIRAYMOND 等[8]构建的猫STR 基因座复合扩增体系的基础上增加了7 个多态性较高的位点，经反复实验和优化后，为满足各基因座在不同荧光间的均衡排布，剔除了2 个引物与整体体系不兼容且无法进一步优化的基因座，成功建立了一个包含16 个猫常染色体STR 基因座和1 个SRY 的复合扩增体系。该体系相较于MENOTTI-RAYMOND 等[8]构建的复合扩增体系，基因座个数由12 个增加至17 个，等位基因数目由172 个增加至259 个，均得到显著提高，其不同荧光标记间各基因座分布、片段大小及间隔控制、PCR 反应条件等均得到有效优化。此外，除SRY 外，本研究选用的基因座均为四核苷酸重复，有效减少了stutter 峰对分型结果的影响。

根据SWGDAM 制定的验证指南[10]，本研究对该复合扩增体系进行了灵敏度、种属特异性、稳定性、准确性、均衡性和混合样本分析等验证实验。经检验，DNA 模板量太高或太低均会对DNA 分型结果造成不良影响，当DNA 模板量为0.125 ng 时，部分基因座出现等位基因丢失现象，无法得到完整分型；当DNA 模板量为2 ng 时，虽然16 个基因座均可得到完整正确的分型结果，但在部分基因座中出现了易导致误判的渗透峰。因此，该复合扩增体系的推荐DNA 模板量为0.25～1 ng。12 种常见动物种属DNA 样本均未出现特异性分型，表明该体系种属特异性良好，应用该体系进行法医物证检验时不会受到其他种属DNA 对分型结果造成的影响。遗留在现场的物证检材经常会混有不同的物质，这类物质往往会抑制后续的PCR扩增过程，为获得完整的STR 分型结果带来困难，稳定性检验结果显示，该体系可耐受一定浓度的PCR抑制剂，当体系中血红素浓度≤200 μmol/L、腐殖酸质量浓度≤100 ng/μL、靛蓝质量浓度≤6 000 ng/μL、黑色素质量浓度≤400 ng/μL 时，均可得到准确分型且图谱清晰可靠。准确性检验结果表明，各等位基因在不同泳道中的电泳迁移率较小，均在0.3 bp 范围内，检测结果准确有效。在不同实验室应用该体系对猫的不同检材进行实验均可得到一致的分型结果，表明本研究构建的复合扩增体系具有良好的组织同一性和可重复性，满足不同案件的需求，可推广应用于日常的检验工作中。为保证杂合子基因分型的准确性，且便于从低模板或降解样本中获得完整的DNA 分型，根据《法庭科学人类荧光标记STR 复合扩增检测试剂质量基本要求》（GB/T 37226—2018），各基因座内杂合子等位基因均衡性应大于0.7，同一荧光标记的各基因座间峰高均衡性应大于0.5，不同荧光标记间的峰高均衡性应大于0.3，本研究构建的复合扩增体系在20 例猫无关个体样本中的均衡性检验结果符合上述要求，表明该体系均衡性良好。此外，混合样本的检验及结果的解读一直是法医物证学检验中的难点，该体系所选用的STR 基因座均为四核苷酸重复，受stutter峰的影响较小，在1∶1、1∶3 的混合比例下，混合样本的两个贡献者均可获得完整的等位基因分型结果，当混合比例进一步增大时，虽不能获得全部分型，但对结果解读仍具有一定的参考意义。以往构建猫复合扩增体系的研究中未对体系系统效能进行评价，无法判断其构建的体系是否满足鉴定实践的要求。本研究对145 例猫无关个体样本进行了群体遗传学调查，计算了各基因座的DP 和PE 等影响体系系统效能的遗传学参数。结果表明，该体系选用的16 个猫STR基因座平均PIC 为0.790，TDP 为1-3.57×10-20，CPE 为1-6.35×10-5，可满足鉴定实践要求[17-18]。

综上所述，本研究构建的复合扩增体系具有较高的灵敏度和均衡性以及良好的耐受性和稳定性，能对不同类型检材的猫DNA 样本进行检测分析，系统效能可满足鉴定实践要求。因此，该体系可以用于猫的种属鉴定、个体识别和亲缘关系鉴定，能够为涉及猫类检材的司法案件提供有效的解决方法，具有良好的应用前景。