不同来源的顺铂对人Bel7402肝癌细胞体外抑瘤作用的比较

舒 骁 田海梅 张 伟 王 玲 和 龙

顺铂是一种广谱抗肿瘤药，其抑制肿瘤的主要作用机制是通过破坏肿瘤细胞的DNA 复制而发挥作用[1-2]，是广泛应用于实体瘤治疗中的重要抗肿瘤药物，与多种抗肿瘤药物有协同作用，且无交叉耐药性。顺铂是周期性特异性药物，注射后广泛分布于肝、肾、前列腺、膀胱、卵巢，亦可到达胸、腹腔，极少通过血脑屏障。顺铂的药动学在人体内符合二室模型，消除半衰期58～73 h，主要通过肾脏排泄。自从1978年顺铂被美国食品和药物管理局（FDA）批准用于肿瘤化疗以来[3]，因其具有疗效确切、抗瘤谱广、抗癌活性高等特点，作为基础药物被广泛应用于临床。顺铂具有许多其他药物无法替代的优势，对睾丸癌的治愈率已超过95%[4]，对肺癌、卵巢癌、头颈部肿瘤等有肯定的疗效[5-10]，尤其是在非小细胞肺癌的药物治疗中作为基础药物被广泛应用[11-12]。

顺铂的剂型包括速溶干粉剂、水针剂、混悬剂、软膏、栓剂、植入剂、顺铂微囊、顺铂脂质体等[13]，临床供静脉使用的顺铂制剂多为冻干粉针剂和水针剂。目前，国内外多家制药企业生产的顺铂制剂获得监管机构批准用于肿瘤治疗，由于在临床实践中发现不同企业生产的顺铂制剂不良反应差异较大，但全球未见不同企业生产的顺铂制剂是否会对疗效具有影响的研究，本研究针对不同制药企业生产的顺铂注射制剂进行了体外细胞毒作用的实验观察和比较，可为进一步研究提供支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器荧光检测仪，北京滨松光子技术有限公司，BHP9504。二氧化碳培养箱，美国Thermo 公司，Forma 3111。

1.1.2 试剂盒ATP 生物荧光药物敏感性检测试剂盒，北京金紫晶生物医药技术有限公司产品。96 孔培养板，Costar 产品。

1.1.3 细胞株人肝癌细胞Bel7402，由中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所生物检测中心提供。

1.1.4 实验药4 种不同来源顺铂制剂见表1。

表1 顺铂制剂来源

1.2 方法

1.2.1 实验药的处理1）注射液：直接使用。2）冻干型：用0.9%氯化钠注射液溶解，终浓度均为1 mg/ml，55 ℃水浴使其完全溶解。

1.2.2 细胞培养将处理好的试验药分别稀释成2.500、1.250、0.625、0.313、0.156 和0.078 μg/ml等6 个浓度，并将此溶液分别加入96 孔培养板中，每孔加入100 μl，每个浓度设定3 个平行孔。取对数生长期细胞，分散成单细胞后计数。向含药孔中加入各种细胞，每孔接种3 500 个细胞。37 ℃，5%二氧化碳培养72 h。同时设立无药对照孔和ATP 生产抑制孔。

1.2.3 测定向96 孔培养板中每孔加入ATP 提取液50 μl，室温下放置5 min。取每孔ATP 提取液50 μl，加入到测定白板中，向每孔加入50 μl 荧光酶/荧光素测定液，混匀后于荧光测定仪上测定吸收值。

1.2.4 统计学分析1）半数抑制浓度：用SPSS 11.5 for Windows PSS 统计软件中probit 法计算。2）检验方法：SPSS 11.5 for Windows 中Kruskal-Wallis H 检验法。

2 结果

2.1 半数抑制浓度

4 种药品对人Bel7402 肝癌细胞的半数抑制浓度结果见表2。

表2 不同药品对人Bel7402 肝癌细胞的半数抑制浓度(μg/ml)

2.2 数据分析

由表3和表4可知：4 种药物对该瘤株抑制作用效果的平均秩分别为2.00、6.00、7.00、11.00；K-W统计量为9.462，概率P值为0.024。若取显著性水平α=0.05，则由于概率P值小于显著性水平α，应拒绝原假设，认为4 种药物作用效果存在显著性差异。

表3 几种实验药对某种疾病的秩和（Kruskal-Wallis） 检验结果（1）

表4 几种实验药对某种疾病的秩和（Kruskal-Wallis） 检验结果（2）

2.3 两两比较

表5用方差分析法得出假设检验的结果，由group 一栏的数据可知，数据转换为秩后的F统计量为16.4，P=0.001。当显著性水平取0.05 时，则拒绝H0，这与用Kruskal-Wallis H 检验的结果一致，即认为不同药物对该疾病作用效果不同。

表5 经秩变变换后的方差分析结果

表6经SNK 法（两两比较）分析得出的结果，由表中的数据可以看出，药物B 和药物C 作用效果的差异不大（0.461＞0.05），该4 种药物的作用效果分属于不同的层次，其中药物D（日本化药）与其他3 种药物的作用效果不同，效果最好。

表6 不同药物对某种瘤株作用效果的多重比较

3 讨论

在4 种不同来源顺铂注射制剂中，4 种药物的作用效果分属于不同的层次，B 和C 的作用效果差异不大，A 种顺铂的体外抑瘤效果最弱，D 种顺铂对人Bel7402 肝癌细胞体外抑瘤作用最强。本实验结果显示，不同厂家生产的顺铂在抑瘤作用上有显著性差异。由于本实验的结果仅为体外研究，不同来源的顺铂制剂在体内的抑瘤作用和药效学研究尚需随机对照临床试验来进一步验证。我国是典型的仿制药大国，并不是仿制药强国，药品的质量和疗效与国人的健康密切相关。仿制药一致性评价工作可使仿制药在质量和疗效方面与原研药品一致，在临床中实现替代原研药品，不仅节约了医疗费用，同时也提高了仿制药在我国的质量和医药行业的整体发展水平，同时可确保公众用药的安全性和有效性。我国仿制药品种数量繁多，但相应一致性评价工作却很不完善，本研究结果就充分暴露了个别药品的质量差异，值得引起业界关注。

顺铂的化学结构是简单的平面四方形，以二价铂为中心，两个氨基为配体，同时连接两个氯作为离去基团。顺铂的活性主要取决于氯离子的浓度[14]，不同价态配位数的铂衍生物与其抗肿瘤活性及毒性的强弱密切相关[15]。顺铂的临床作用发挥有赖于有效的剂量浓度和生物学活性。本研究中4 种不同来源的顺铂是来自市售企业生产的合格产品，在临床上较常见。按照现行《中华人民共和国药典》（ChP2020）、《欧洲药典》（EP9.0）、《美国药典》（USP40）和《日本药典》（JP17），顺铂注射制剂含量测定均采用高效液相色谱法（HPLC）[16-19]，检测标准比较一致，说明不同企业生产的顺铂制剂在含量上差异不大，但本研究发现在体外抑瘤作用存在显著差异，笔者分析，也正因为有这种现象的存在，所以国家必须要对注射剂进行一致性评价。长期以来，注射剂型一直在国内肿瘤化疗药市场占据着主导地位[20]，注射剂的一致性评价是对我国仿制药的一次重新洗牌，将全面提升我国仿制药的质量，保证与原研产品质量和疗效的一致。注射剂一致性评价的技术要求已逐渐与国际要求接轨，将对我国注射剂的研发和生产提出更高的要求，以充分保障药品的安全、有效和质量可控。仿制药的一致性评价工作对中国医药行业的发展具有深远的影响，通过一致性评价的产品必将在未来医药市场竞争中发挥积极作用。在国家政策的大力支持下，大型企业纷纷转型升级。仿制药是一种巨大的社会公共财富，与原研药相比价格较低，能够提升医疗服务水平，降低医疗支出，维护公众的健康，具有良好的经济效益和社会效益。我国仿制药起步虽晚，但是发展迅速，目前已成为世界上最大的仿制药生产国。由于我国早期批准上市的仿制药没有强制要求与原研药进行一致性评价，有些药品在疗效上与原研药存在差距，在此背景下，我国提出了仿制药一致性评价工作要求，随着注射剂仿制药一致性评价工作有序推进，国内企业生产的优质仿制药在满足我国人民群众基本医疗保障的同时也会带动中国逐步从制药大国走向制药强国[21]。

本研究在体外实验中发现不同厂家生产的顺铂在抑瘤作用上有显著性差异，但在体内试验中是否也会出现同样的结果，有待于相关临床专家开展随机对照研究来逐步验证。