RNA 干扰β-catenin 基因对大肠癌细胞SW480的生长抑制及基因表达
2022-07-30李鑫鑫李安庆赵卫东纪红梅王峰
李鑫鑫 李安庆 赵卫东 纪红梅 王峰
(滨州医学院附属临淄区人民医院消化内科,山东 淄博 255400)
RNA干扰(RNAi)是小片段双链RNA分子(siRNA)介导的生物细胞内同源基因的特异性转录后基因沉默现象。是研究基因功能的一种重要技术,目前已广泛用于基因组的研究及肿瘤的治疗研究。研究认为,Wnt/β-catenin 信号通路在大肠癌的发生发展中起重要作用。90%以上的大肠癌存在 Wnt/β-catenin 信号通路的激活以及β-catenin 在细胞内的积聚。调节β-catenin 在胞内的稳定及积累是Wnt 信号通路中最关键的事件之一。本试验通过 RNA干扰技术,诱导β-catenin 基因沉默,探讨 RNA干扰技术对大肠癌治疗的价值。
1 材料与方法
1.1试验材料
1.1.1试验细胞 大肠腺癌细胞株 SW480由四川大学华西医院消化外科与器官微循环试验室提供。
1.1.2主要试剂 转染试剂lipofectamine2000、Trizol(Invitrogen公司);RPMI1640培养基、新鲜胎牛血清(Gibco公司);siRNA双链体 (上海吉玛制药技术有限公司);二甲基亚砜(DMSO)、四甲基偶氮唑蓝(MTT)、碘化丙啶(PI,Sigma公司);引物合成及探针修饰(上海生工生物工程公司);Taq DNA聚合酶、聚合酶链反应(PCR)缓冲液(10X)、MarkerDL2000 (TaKaRa公司);琼脂糖 (Bio west公司)。
1.1.3主要仪器 Class II A/B3超净工作台、恒温二氧化碳培养箱(美国Thermo Forma公司);高速离心机(德国Heraeus公司);实时荧光定量基因扩增仪 iCycler iQ、Model 550酶免疫检测仪(美国Bio-Rad)。
1.2试验方法 siRNA的设计与合成根据 siRNA 设计原则设计并合成β-catenin基因编码区的3个siRNA序列,如下:siRNA片段1正义链5′-GGAUGUGGAUACCUCCCAATT-3′,反义链5′-UUGGGAGGUAUCCACAUCCTT-3′;siRNA片段2正义链5′-CCCACUAAUGUCCAGCGUUTT-3′,反义链5′-AAC-GCUGGACAUUAGUGGGTT-3′;siRNA片段3正义链5′-GCUGGUGGAAUGCAAGCUUTT-3′,反义链5′-A-AGCUUGCAUUCCACCAGCTT-3′;无意义链正义链5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′,反义链5′-AC-GUGACACGUUCGGAGAATT-3′。siRNA 模板合成后,根据体外转录试剂盒进行操作。
1.2.1细胞复苏及传代 SW480细胞株解冻后,加入预热的RPMI1640 培养基,离心,移去上清液,再加入新鲜的RPMI1640完全培养基(含10%胎牛血清、20 mmol/L碳酸氢钠、100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素),37℃ CO2培养箱培养。待细胞融合生长至80%培养瓶底面时,用0.25%胰蛋白酶溶液制成悬液,混合均匀后,按1∶2~1∶3比例转移至新培养瓶中,每2~3 d传代1次,试验所用细胞处于对数生长期。
1.2.2siRNA 双链体转染 siRNA 转染前24 h,用胰蛋白酶消化回收细胞,以1∶10的比例用不含抗生素的RPMI1640培养基稀释细胞,向六孔板的每孔中加入2 ml的细胞悬液,每孔中大约有3×105个细胞。细胞接种24 h后进行转染,确保转染时细胞密度为50%~80%。在一个EP管(A管)中加入4 μl 20 μmol/L的siRNA双链体和296 μl的RPMI1640培养基混匀,在另一个EP管(B管)中,向292 μl的RPMI1640培养基中加入8 μl脂质体Lipofectamine2000,将A管溶液缓慢加入B管溶液中,轻混,于室温孵育20~25 min形成脂质体复合物。将脂质体复合物按每孔600 μl加入SW480细胞中,并设阴性对照和空白对照。通过轻轻敲击培养板30 s以使之混匀,将细胞培养板于37℃ 5%CO2的培养箱中孵育4~6 h后观察不同时间点的作用。
1.2.3RT-PCR
1.2.3.1引物和探针设计 β-catenin 正义链5′-CCTGCCATCTGTGCTCTTC-3′,反义链5′-GACAAA-GGGCAAGATTTCGA-3′,β-catenin探针5′-FAM-TGACCAGCCGACACCAAGAAGCA-ECLIPSE-3′β-actin正义链5′-AAGGCCAACCGCGAGAA-3′,反义链5′-CCTCGTAGATGGGCACA-3′,β-actin探针5′-FA-MTCAACACCCCAGCCATGTACGTTAMRA-3′。用FAM荧光作报告基团标记探针5′端,用 TAMRA 荧光淬灭基团标记 3′端。
1.2.3.2RT-PCR检测细胞β-catenin mRNA表达 取6孔板5个,每孔接种3×105个细胞培养,每孔加入2 ml培养基,细胞培养24 h贴壁后转染,分组为 siRNA1组、siRNA2组、siRNA3组、阴性对照组、空白对照组,每组设置复孔6个。其中siRNA组转染细胞时加入合成的β-catenin siRNA , 阴性对照组转染细胞时加入合成的阴性对照 siRNA。转染后继续培养48 h。Trizol reagent 提取细胞总 RNA,参照说明书逆转录后PCR扩增,参照 GENE BANK 序列设计引物。设 GAPDH 为内参,并设相应的阴性对照和空白对照,PCR条件:94℃ 2 min 1个循环,94℃ 20 s,54℃ 20 s,70℃ 30 s 80℃ 20 s,共 40 个循环。增益率为 1.5。PCR 产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定。
1.2.4MTT比色法 以5×103个/孔的细胞浓度接种细胞于96孔板,每孔加入200 μl培养基,每组设6个复孔,置于37℃CO2孵箱中培养24 h后转染,实验终止前4 h加 MTT 20 μl/孔,继续 37℃孵育,最后吸去孔内液体,加入 DMSO 150 μl/孔,震荡10 min。选择 490 nm 波长,测定各孔光吸收值。计算每组细胞增殖抑制率,并在倒置显微镜下观察细胞的形态变化。增殖抑制率=(1-siRNA组光吸收值/对照组光吸收值)×100%
1.2.5流式细胞仪检测细胞周期及凋亡 细胞的接种与收集:取6孔板5个,每孔接种3×105个/ml细胞培养,每孔加2 ml培养基,贴壁24 h后转染,转染48 h后用胰蛋白酶消化,制成细胞悬液,约1×106个/ml,细胞悬液离心,弃上清液,加1 ml磷酸盐缓冲液(PBS)到离心管中,用1 ml枪头吹打均匀后移入1 ml EP管,再次离心后弃上清液,加1 ml -20℃预冷的冰乙醇(70%乙醇)到小EP管中,蜗旋振荡器上震荡细胞至分散,置于4℃冰箱冷藏过夜。离心后将等体积的细胞悬液和PI染液混合,4℃放置20~30 min,测定前将样品用300目尼龙膜过滤,将样品加入FCM样品室,以激发波长488 nm测定。
1.3统计学方法 采用SPSS25.0软件进行单因素方差分析、t检验。
2 结 果
2.1RT-PCR检测 siRNA1、siRNA2、siRNA3组β-catenin mRNA表达均明显低于阴性对照组及空白对照组(P<0.01)。siRNA1组、siRNA3组β-catenin mRNA表达明显低于siRNA2组(P<0.01),说明siRNA1组、siRNA3组干扰抑制作用优于siRNA2组,前两组对靶基因的干扰特异性优于后者。siRNA1组和siRNA3组β-catenin mRNA表达无显著差异(P>0.05)。阴性对照组(无意义链)和空白对照组β-catenin mRNA表达无显著差异(P>0.05),证明非特异链不产生干扰效果。 见表1。
2.2流式细胞仪检测SW480细胞的凋亡率 siRNA转染后48 h,siRNA1、siRNA2、siRNA3组细胞凋亡率明显高于阴性对照组及空白对照组(P<0.05)。siRNA1组、siRNA3组细胞凋亡率明显高于siRNA2组(P<0.05)。说明siRNA组、siRNA3组干扰抑制作用比siRNA2组更强,siRNA1组、siRNA3组对靶基因的特异性优于siRNA2组。而阴性对照组和空白对照组的凋亡率无显著差异(P>0.05)。见表1。
2.3MMT比色法 siRNA1、siRNA2、siRNA3组增殖抑制率明显高于阴性对照组及空白对照组(P<0.05)。转染后48 h及72 h siRNA1组、siRNA3组增殖抑制率明显高于siRNA2组(P<0.05)。说明siRNA1组、siRNA3组对靶基因的干扰特异性优于siRNA2组。siRNA1组和siRNA3组增殖抑制率无显著差异(P>0.05)。阴性对照组和空白对照组增殖抑制率无显著差异(P>0.05)。各siRNA组增殖抑制率均有时间依赖性(P<0.05)。见表2。
表2 各组细胞增殖抑制率比较
3 讨 论
结肠癌是临床常见的恶性肿瘤,其发病率位于消化道肿瘤的第 3 位。具有恶性程度高、浸润性生长、易发生远处转移及易复发等生物学特点〔1,2〕。尽管诊疗技术的提高使结肠癌患者的预后有所改善,但晚期结肠癌患者的 5 年生存率仍然较低〔3〕。研究显示多种人类肿瘤细胞中存在miRNA的异常表达,表明miRNA 的异常表达参与了肿瘤的发生发展〔4~8〕。不同的 miRNA 通过发挥癌基因和抑癌基因的作用参与细胞增殖、凋亡和侵袭转移的调控,进而影响肿瘤的发生、发展过程〔9,10〕。研究发现,Wnt/β-catenin信号通路广泛参与生物体内细胞信息调控,在细胞增殖、组织修复及多种肿瘤的发生发展中发挥重要作用〔11〕。β-catenin作为多种miRNA的调控靶基因,能够通过进一步调控下游靶基因,对一系列生物学事件(如细胞增殖、凋亡、侵袭转移等)进行干预,最终影响多种肿瘤的发生发展〔12〕。研究表明,β-catenin在诸如肝癌〔11〕、胃癌〔13,14〕、结肠癌〔15〕中高表达,证实,Wnt/β-catenin信号通路在大肠癌的发生发展过程中起重要作用〔15〕。Wnt通路被激活时,β-catenin进入细胞核,与转录基因结合,启动靶基因的表达,激活靶基因的致癌作用〔16〕。RNA干扰技术已成为一个很好的反向遗传学研究工具,被广泛用于基因功能的研究〔17~19〕和基因治疗方式的研发〔20,21〕。其原理是双链RNA(dsRNA)在细胞质内被一种称为Dicer的酶特异识别并剪切成长度为20~23 bp的siRNA;然后siRNA被组装到RNA诱导沉默复合体(RISC)中。RISC被激活后,siRNA双链被解链成正义链与反义链,反之siRNA链按照碱基互补的原则与靶标mRNA完全互补结合,引导RISC对mRNA进行切割。mRNA被切割后降解,基因表达因此受到抑制〔17~19〕。
本研究证实靶向β-catenin 的 RNAi 可以有效诱导β-catenin 基因沉默, 有效抑制β-catenin蛋白的表达;针对β-catenin 的靶向 siRNA 可有效抑制大肠腺癌 SW480 细胞增殖,说明针对β-catenin 的 RNA 干扰对结肠癌 SW480 细胞的生长具有抑制作用。本研究结果考虑作用机制如下: 经典 Wnt/β-catenin 信号通路的 Wnt配体与 卷 曲 蛋 白(FZD)受体及共同受体相关蛋白(LRP)5/6 结合,启动 Wnt 信号通路,DVL蛋白磷酸化后,将信号传导入细胞内,抑制多发性腺瘤病大肠杆菌(APC)、糖原合成酶激酶(GSK)-3β、轴蛋白(AXIN)、β-catenin复合体酶活性,进而β-catenin蛋白不被磷酸化,防止泛素蛋白酶对其识别降解。在 Wnt 信号缺失情况下,β-catenin能被磷酸化后的多蛋白复合体降解。该多蛋白复合体失活情况下,β-catenin将在细胞质内大量蓄积,达到一定浓度时进入细胞核内与T细胞因子(TCF)结合,激活 TCF 转录,进而导致下游靶基因进一步转录〔22〕。RNAi技术可通过诱导β-catenin基因沉默并阻止β-catenin激活Wnt信号通路,从而抑制结肠肿瘤的生长。 β-catenin 的表达与大肠癌生长、转移密切相关,并可作为判断预后的指标〔16〕。阻断β-catenin 表达可达到抑制肿瘤生长及转移的目的〔16〕。如何有效抑制β-catenin 的表达是肿瘤治疗的关键所在。RNA 干扰为肿瘤的分子生物治疗开辟了新的途径,提供了新思路。