桑叶总黄酮经自噬途径抑制NLRP3 炎症小体对糖尿病心肌病大鼠心肌的影响

杨卫杰 曹晶晶

(河南医学高等专科学校，河南 新郑 451191)

糖尿病心肌病(DCM)为糖尿病患者严重的并发症，代谢紊乱、氧化应激、微循环障碍、炎症反应、自噬作用均参与了该病的发病过程〔1〕。核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白(NLRP)3炎症小体作为炎症反应的中心环节，对DCM的发生具有一定的促进作用，而细胞自噬在部分相关疾病中对NLRP3炎症小体的激活具有一定的负向调控作用〔2〕。桑叶总黄酮(MLF)是从中草药桑干燥叶中提取的有效成分，具有降低血糖水平和改善胰岛素敏感性等多种治疗作用，并对肾间质纤维化具有一定的防治作用〔3〕，但其对心肌病的作用的研究报道较少。本研究探讨MLF对DCM大鼠的心肌细胞的影响，并进一步探讨其对细胞自噬和NLRP3炎症小体的影响并分析其机制。

1 材料与方法

1.1药物与动物 桑叶饮片(批号：20180924)购自四川省中药饮片有限责任公司。依据预实验，选择70%乙醇按照1∶20的料液浸泡12 h，70℃、540 W条件下，采用超声波提取仪提取3次，每次1 h，合并提取液，减压浓缩得浓缩液。浓缩液上AB-8大孔树脂，选择75%乙醇洗脱液，减压浓缩，真空冷冻干燥得MLF粉末。亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠比色法测得总黄酮质量分数为88.4%。SPF级雄性SD大鼠，体重(190±10)g，购自河南省实验动物中心，许可证号：SYXK(豫)2016-0002。

1.2试剂与仪器 二甲双胍(中美上海施贵宝制药有限公司，国药准字H20023370)；链脲佐菌素(上海懋康生物科技有限公司，批号180114)；肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒(南京建成生物研究所，批号20180312、20180129)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术研究所，批号P0012S)；自噬效应蛋白(Beclin)-1(编号AF5123)、自噬微管相关蛋白轻链(LC)3 Ⅱ(编号AF5225)抗体购自上海碧云天生物技术有限公司；一抗NLRP3(批号ab232401)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-1(批号ab179515)、凋亡相关微粒蛋白(ASC，批号ab47092)及二抗IgG(羊抗兔，批号ab150077)购自美国Abcam公司。白细胞介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子(TNF)-α试剂盒(南京建成生物研究所，批号20180312、20180226)。AL104 型电子天平(瑞士梅特勒托利多仪器公司)；RE-52AA 型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；UV-2501PC 型紫外分光光度计(日本岛津公司)。

1.3模型建立 50只大鼠给予高脂饲料(10%精制猪油，20%蔗糖，8%蛋奶精粉，2%胆固醇和60%正常食物)喂养，持续8 w。动物腹腔内注射35 mg/kg的链脲佐菌素(溶于柠檬酸盐缓冲液(pH4.5)，另取10只注射同体积的柠檬酸盐缓冲液作为对照。72 h及7 d后检测空腹血糖水平>16.7 mmol/L则糖尿病模型建模成功。

1.4分组与给药 建模成功的50只大鼠随机分成模型组、阳性对照组(二甲双胍140 mg/kg)、MLF低剂量组(50 mg/kg)、MLF中剂量组(100 mg/kg)、MLF高剂量组(200 mg/kg)，而普通喂养且未造模的10只大鼠为对照组。建模成功后，大鼠每天按照设定剂量灌胃给药，MLF均以5%羧甲基纤维素钠混悬，对照组和模型组均给予对应体积的5%羧甲基纤维素钠，连续6 w。给药期间，模型组、给药组给予高脂饲料喂养，对照组给予普通饲料喂养，自由饮水。

1.5心功能指标检测 大鼠给药后禁食12 h，水合氯醛(10 mg/ml)麻醉大鼠，小动物超声成像系统(Vivid 7，GE Medical，美国)经胸检查，记录左室射血分数(LVEF)、舒张早期二尖瓣血流速度与舒张晚期二尖瓣血流速度比值(E/A)、左室等容舒张时间(IVRT)。

1.6标本采集 超声检查结束后，称重、麻醉、固定、胸腔打开，左心室取血3 ml，3 000 r/min 8 min，得血清，-80℃冰箱保存。剥离心脏，吸干表面水分，取左心室1/2置于液氮罐内备存。

1.7血清中CK、LDH水平检测 取血清，采用微板法检测LDH活性，比色法检测CK活性，检测过程严格按照说明书过程要求操作进行。

1.8心肌组织内自噬水平检测 Western印迹检测心肌组织中Beclin-1、LC3 Ⅱ水平，取冻存的心肌组织，研磨，加细胞裂解液，冰上匀浆、裂解，14 000 r/min离心10 min，取上清液，BCA比色测定法估算裂解液的蛋白质含量。将裂解液样品置于十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶上，然后将其转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用5%脱脂奶封闭2 h，将PVDF膜与抗Beclin-1、LC3 Ⅱ的一抗(1∶2 000、1∶2 000)在4℃孵育过夜。将膜与辣根过氧化物酶(HRP，1∶1 000)耦联的二抗孵育50 min。凝胶成像系统分析各条带的灰度值，以β-actin为内参分析各蛋白条带的相对表达水平。

1.9心肌组织中IL-1β、TNF-α水平表达 称取心肌组织100 mg，加入生理盐水冰浴匀浆，4℃ 14 000 r/min离心10 min，取上清，酶联免疫吸附试验(ELISA)测定IL-1β、TNF-α水平。检测过程严格按照说明书过程要求操作进行。

1.10心肌组织NLRP3炎症小体激活情况检测 Western印迹检测心肌组织中NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白水平，方法参照1.8。

1.11统计学分析 采用SPSS18.0软件进行单因素方差分析、LSD-t检验。

2 结 果

2.1各组心功能指标比较 与模型组比较，对照组LVEF、E/A、IVRT水平均明显升高(P<0.01)；与模型组比较，阳性对照组及MLF各剂量组LVEF、E/A、IVRT水平均明显增加，MLF低剂量组0.05)。见表1。

表1 各组心功能指标比较

2.2各组血清中CK、LDH水平比较 与模型组比较，对照组CK、LDH水平均明显降低(P<0.01)；与模型组比较，阳性对照组和MLF各剂量组CK、LDH水平均明显降低，且MLF低剂量组>MLF中剂量组>MLF高剂量组，差异均有统计学意义(均P<0.01)；与阳性对照组比较，MLF低、中剂量组CK、LDH水平明显增加(P<0.01)，MLF高剂量组CK水平明显增加(P<0.05)，而LDH水平无显著差异(P>0.05)。见表2。

2.3各组心肌组织内自噬水平比较 与模型组比较，对照组Beclin-1、LC3 Ⅱ水平均明显降低(P<0.01)；与模型组比较，阳性对照组及MLF各剂量组Beclin-1、LC3 Ⅱ水平均明显增加，且MLF低剂量组0.05)。见图1、表2。

1～6:对照组、模型组、阳性对照组、MLF低剂量组、MLF中剂量组、MLF高剂量组；图2同图1 各组心肌组织内自噬水平比较

2.4各组心肌组织中IL-1β、TNF-α水平比较 与模型组比较，对照组IL-1β、TNF-α水平均明显降低(P<0.01)；与模型组比较，阳性对照组与MLF组各剂量IL-1β、TNF-α水平均明显降低，且MLF低剂量组>MLF中剂量组>MLF高剂量组，差异均有统计学意义(P<0.05，P<0.01)；与阳性对照组比较，MLF低、中剂量组IL-1β、TNF-α水平明显增加(P<0.01)，MLF高剂量组各指标无显著差异(P>0.05)。见表2。

表2 各组血清中CK、LDH水平及心肌组织内自噬水平和IL-1β、TNF-α水平比较

2.5各组心肌组织NLRP3炎症小体激活情况 与模型组比较，对照组NLRP3、ASC、Caspase-1水平均明显降低(P<0.01)；与模型组比较，阳性对照组与MLF各剂量组NLRP3、ASC、Caspase-1水平均明显降低，且MLF低剂量组>MLF中剂量组>MLF高剂量组，差异均有统计学意义(P<0.01)；与阳性对照组比较，MLF低、中剂量组NLRP3、ASC、Caspase-1水平明显增加(P<0.01)，MLF高剂量组各指标无显著差异(P>0.05)。见表3、图2。

表3 各组心肌组织NLRP3 炎症小体激活情况比较

图2 各组心肌组织NLRP3 炎症小体激活情况

3 讨 论

以往的研究主要集中在桑叶中提取的总黄酮的降血糖作用〔4〕及其可预防胰岛损伤〔5〕，但其对心肌病作用的研究较少。本研究结果说明MLF能有限改善心脏功能，保护心肌损伤，减少心肌重构。

研究显示，DCM中促炎性细胞因子(IL-1β，TNF-α)的释放增加，促进了DCM的发展。因此，减少炎症是阻碍DCM发展的有效策略〔6〕。研究显示，NLRP3炎性小体由NLRP3受体和凋亡相关斑点样蛋白组成，其中包含ASC和Caspase-1前体。NLRP3受体的激活刺激了NLRP3炎性体，将前体Caspase-1转化为裂解的Caspase-1〔7〕。在此基础上，通过剪切IL-1β前体，激活其成熟和分泌，从而发挥生物学作用。活化的NLRP3炎性体产生大量炎症细胞因子，如IL-1β和TNF-α，它们在各种慢性疾病中发挥作用，包括糖尿病。在糖尿病相关研究中，链脲佐菌素注射会增加NLRP3诱导的炎症，因此NLRP3炎性小体抑制可改善DCM模型的心脏功能障碍〔8〕。本研究结果说明MLF抑制 NLRP3 炎症小体介导的炎症反应是其发挥对心脏保护作用的重要机制，同时也说明抑制心脏炎症可能是一种治疗DCM的策略。

自噬作为一种细胞内的分解代谢过程，可在不利的环境条件下(如氧化应激和高血糖症)维持细胞稳态。最近的研究表明，自噬在1型和2型糖尿病动物模型的心脏中受到抑制，这表明自噬的抑制可能促进DCM的进展〔9〕。自噬通过直接消除活性炎症小体和间接去除如活性氧(ROS)、细胞内病原微生物或受损细胞器等炎症刺激物来减轻炎症〔10〕。本研究结果说明MLF能诱导心肌细胞发生自噬作用。研究显示，自噬对NLRP3炎性小体的激活具有一定的调节作用，二者相互影响，表现为自噬对NLRP3炎性小体具有负性调控作用。研究显示，在自噬诱导的模型中，NLRP3炎性小体受到有效的抑制，IL-1β水平明显降低。而细胞自噬还可通过自我消化过程，将NLRP3炎性小体组分隔离开来，抑制NLRP3炎性小体的活化和进展〔11〕。结合本研究结果分析显示，MLF对NLRP3炎性小体组分活化的抑制作用，可能与其诱导心肌细胞自噬有关。

综上，MLF能有效地抑制心肌细胞NLRP3 炎症小体组分的活化，并达到对DCM进展的抑制作用，其机制可能与诱导心肌细胞自噬有关。