蒙药壮西-4味散对维甲酸诱导大鼠骨质疏松的治疗作用

图布新 辛颖 李桂花 瑟·道尔吉巴图 色·色日道尔吉

(1内蒙古民族大学附属医院，内蒙古 通辽 028000；2蒙古国国立医科大学；3内蒙古民族大学蒙医药学院)

骨质疏松威胁着人类的生活与生存质量，是由多种因素引起的以骨密度(BMD)下降和骨微结构破坏为主要特征的系统性骨病，发病机制尚未完全阐明，骨吸收和骨形成都与之相关〔1，2〕。

蒙医对“骨枯症”的发病机制及临床表现的描述与骨质疏松相符。蒙医认为“骨枯症”是一种病因众多而复杂的全身疾病〔3,4〕，治疗以辨证施治为原则，通过健脾养胃、改善消化，促进食物的吸收是治疗骨质疏松的关键〔5〕。蒙药壮西-4味散，记载于《中国医学百科全书·蒙医卷》中，由寒水石、肉苁蓉、冰糖和地格达组方〔6〕，具有清“协日”、消食止吐、止泻等功效。目前，临床上依据蒙医理论结合现代医学评价指标，应用蒙药壮西-4治疗骨质疏松的疗效较好〔7〕。现代医学认为基础补钙是骨质疏松治疗关键，有研究发现壮西-4的单药寒水石富含硫酸钙，能够激活成骨细胞活性，增加骨保护素，促进骨吸收〔8〕。单药肉苁蓉具有一定的滋补作用，通过多通路发挥雌激素样作用而对抗骨质疏松〔9,10〕。单药地格达可作用于胃脏，保证机体清浊代谢的顺利进行。鉴于此，蒙药壮西-4可能通过补充钙离子(Ca2+)以调节骨矿物质的代谢；通过发挥雌激素样作用、增强胃脏对药物的吸收等方面治疗骨质疏松〔11,12〕。本研究通过建立维甲酸所致骨质疏松大鼠模型，观察蒙药壮西-4味散对骨质疏松的治疗作用，旨在为其进一步的临床应用提供实验依据。

1 材料和仪器

1.1实验动物 SD雌性大鼠60只，体重180～200 g，由吉林大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK(辽)2015-0001。

1.2药物与试剂 壮西-4味散(内蒙古民族大学附属医院制剂室，批号M15060996)；钙尔奇D片(德国，批号190003887)；维甲酸(陕西森弗生物技术有限公司，批号SCI120308-03)；Ca测试盒(南京建成生物工程研究所，批号20181221)；磷(P)测试盒(南京建成生物工程研究所，批号20181227)；雌激素(E2)测试盒(南京建成生物工程研究所，批号20181222)；降钙素(CT)测试盒(南京建成生物工程研究所，批号20190118)；碱性磷酸酶(ALP)试剂盒(浙江伊利康生物技术有限公司，批号A059-1)。

1.3主要仪器 X射线BMD检测仪(Lunar iDXA，美国GE Medical Systems Ultrasound & Primary CareDiagnostics LLC)；全自动多功能酶标仪(MK3，芬兰雷勃)；全自动生化分析仪(AU640，日本OLYPUS公司)；组织石蜡包埋机(SYD-B，沈阳誉德电子仪器有限公司)；低速自动平衡离心机(DT5-5，北京时代北利离心机有限公司)；全谱直读艾离子体发射光谱仪(prodigyxp，美国俐谩公司)；光学显微镜(BX51，日本OLYPUS公司)。

1.4动物分组和模型制作 雌性SD大鼠，适应性饲养1 w后，随机分为6组：正常对照组，模型组，阳性药物组和壮西-4味散低、中、高剂量组，每组10只。除正常对照组外，其余各组大鼠每天灌胃维甲酸70 mg/kg〔13〕，给药周期为14 d。给药结束后选取空白对照组和模型组大鼠，用CT扫描进行BMD分析，测定血清中ALP水平，以检测是否造模成功。模型成功后，阳性药物组给予钙尔奇D片混悬液(1.322 g/kg)、壮西-4味散低、中、高剂量组分别给予壮西-4味散(0.514 g/kg、1.056 g/kg、2.112 g/kg)，正常对照组和模型组均给予蒸馏水，连续给药14 d后处死动物。

1.5主要观察指标 (1)一般情况。造模及药物治疗前后仔细观察大鼠体毛色泽、神志、四肢活动、食量增减、体重变化。(2)BMD检测。常规麻醉大鼠后使其四肢展开俯卧在X射线BMD仪的扫描床上，打开电脑终端的小动物BMD检测软件系统，进行全身BMD扫描，得到头、上肢、大腿、躯干、肋骨、脊柱、骨盆、全身的BMD，通过仪器自带软件进行大腿BMD分析。(3)尿中Ca和P测定。大鼠处死前1 d置于代谢笼中收集24 h尿液，-20℃保存待测。(4)血清指标的测定。选择腹主动脉采血，分离血清，全自动生化分析仪检测血清中Ca、P、ALP、E2和CT含量。(5)形态检查。处死动物后取其右侧的股骨，去掉附着的软组织后固定于10%甲醛溶液，固定24 h后，锯下近端1/3放入10%硝酸液中，脱Ca 6～8 h，流水冲洗2～4 h，常规脱水。按股骨的长轴包埋，用切片机沿肌长轴切片，切片厚度5 μm，苏木素-伊红(HE)染色后光镜观察。在低倍(10 × 40倍)视野下测定骨小梁面积。

1.6统计学分析 采用SPSS22.0软件行方差分析。

2 结 果

2.1大鼠一般情况 给药14 d时，正常对照组大鼠活动正常、灵活、毛色光泽，而模型组与正常对照组相比，大鼠活动明显减少，体重显著减轻〔(263.23±15.43)g vs (257.59±10.01)g,P<0.05〕，食量减少，反应迟钝体毛枯疏；阳性药物组及壮西-4味散低、中、高剂量组与模型组比较活动较多，毛色较好，体重显著增高〔(268.13±10.96)g、(266.82±11.33)g、(264.83±17.88)g、(269.30±11.33)g，P<0.05〕，与正常对照组无明显差异(P>0.05)。

2.2骨质疏松模型建立成功 与正常对照组比较，模型ALP明显增高(P<0.05)，BMD显著降低(P<0.01)。见表1。结果表明骨质疏松模型造模成功。

表1 造模14 d维甲酸对大鼠血清ALP、BMD指标的影响

2.3壮西-4味散对大鼠BMD的影响 与正常对照组比较，模型组BMD显著降低(P<0.05)。与模型组比较，各给药组BMD显著增高(P<0.05)，见表2。

2.4壮西-4味散对骨质疏松大鼠尿中Ca和P的影响 与正常对照组比较，模型组尿中Ca、P显著增高(P<0.05)；各给药组与模型组比，Ca、P明显降低(P<0.05)。见表2。

2.5壮西-4味散对骨质疏松大鼠血清中Ca和P的影响 与正常对照组比较，模型组血清Ca、P明显降低(P<0.05)；与模型组比较，阳性药物组和壮西-4味散中、高剂量组血清中的Ca、P水平均显著升高(P<0.05)。见表2。

表2 壮西-4味散对骨质疏松大鼠BMD、Ca、P、血清骨代谢因子的影响

2.6壮西-4味散对骨质疏松大鼠血清中骨代谢因子的影响 与正常对照组比较，模型组血清ALP明显增高(P<0.05)，E2、CT明显降低(P<0.05)；与模型组比较，阳性药物组和壮西-4味散低、中、高剂量组血清中的E2、CT均显著升高(P<0.05)，ALP水平均显著降低(P<0.05)。见表2。

2.7各组股骨骨小梁面积 与正常对照组〔(52.22±1.21)%〕比较，模型组股骨骨小梁面积〔(29.79±4.95)%〕明显变小(P<0.01)；与模型组比较，壮西-4味散低、中、高组和阳性药物组骨小梁面积显著增多〔(39.43±4.19)%、(45.86±4.48)%、(46.78±7.66)%、(36.87±8.06)；P<0.05〕。

2.8各组股骨骨组织病理形态学 光镜下观察显示，正常对照组可见骨小梁丰富、饱满；模型组大鼠骨小梁稀少、变细；各给药组骨小梁比模型组有所增宽。见图1。

图1 各组股骨骨组织病理形态学(HE染色，×400)

3 讨 论

维甲酸又称维生素A酸，是维生素A的衍生物，可激活破骨细胞而促进骨吸收，导致BMD下降。维甲酸灌胃14 d后就即可出现骨松质和骨皮质容量明显减少，骨组织微结构的病理改变，骨小梁数量下降，骨小梁分离，骨髓腔增大，皮质骨变薄和BMD降低。采用维甲酸制作的骨质疏松实验模型所需时间短，虽然在病因上与人类骨质疏松不同，但此模型在发病症状、组织形态学表现及对E2的骨反应上与人类有较大的相似性，是大鼠急性骨质疏松的常用模型，在药物的开发研究中被普遍采用〔14〕。

BMD降低是骨质疏松的重要表现之一，因此BMD可以作为骨质疏松的评判标准之一，也可以作为评价骨质疏松疗效的客观指标。临床上双能X线BMD仪检测BMD为诊断骨质疏松的金标准〔15〕。因其测值准确且操作灵活，同样适应于实验鼠的检测〔16,17〕。

空腹尿Ca、P主要来源于骨盐的分解，故其排出量可反映骨吸收的状况，壮西-4味散可以抑制维甲酸致骨Ca流失。体内Ca、P 95%聚集在骨骼中，骨骼中Ca、P的含量受到血Ca、P、激素调节、外部补充等的影响。壮西-4味散可提高血中的Ca、P含量，可能是其属于含Ca类药物。

血清ALP含量是常用的评价骨形成和骨转换的指标。血清中ALP有50%来自于骨，骨ALP由成骨细胞分泌，而另一半绝大部分来源于肝脏。血清 ALP活性可反映成骨细胞活跃情况。壮西-4味散可以降低血清ALP，具有抑制骨吸收，降低骨转换，提高骨质量的作用。

E2可与成骨细胞上E2受体相结合，促进细胞骨保护素(OPG)表达增加，OPG是核因子κB受体活化因子(RANK)配体(RANKL)-RANK-OPG轴的重要因素，OPG不仅可以促进破骨细胞凋亡，还可以与RANKL竞争性结合RANK，抑制破骨细胞生成分化〔18，19〕。当E2缺乏时，可引起RANK/RANKL信号通路过度激活，促进破骨细胞分化，导致骨吸收增加。含E2类中药可通过类E2样作用增加骨Ca、P含量，提高BMD而达到防治骨质疏松的作用〔20〕。CT由甲状腺滤泡旁细胞产生和分泌，是参与Ca、P代谢调节的多肤类激素。其主要生理作用是降低破骨细胞的数量，抑制破骨细胞的活性，减少骨吸收；同时可抑制小肠对Ca2+的吸收，降低体内血Ca浓度，使血中游离Ca向骨组织中转化〔21〕。CT对成骨细胞具有直接作用，可以增加成骨细胞ALP的活性，促进骨的形成和矿化过程。通过对成骨细胞的调节，促进成骨细胞增殖和分化，有利于骨形成，增加BMD〔22〕。壮西-4味散可通过升高E2和CT水平达到治疗骨质疏松的作用。

骨组织强度与骨量有关，还与骨组织结构关系密切〔23〕。骨量减少是骨质疏松的主要病理变化之一，亦是引起骨质疏松骨折的一个主要原因。本实验结果显示，壮西-4味散能有效阻止维甲酸导致的骨矿物丢失和骨组织纤维结构的改变，阻止骨质量降低。

综上所述，壮西-4味散能有效升高维甲酸所致骨质疏松模型大鼠的血Ca、P，降低尿Ca、P，增加BMD，抑制骨吸收，促进骨形成，改善骨代谢的负平衡状态，对维甲酸导致的骨质疏松具有良好的治疗作用。其防治作用机制可能是蒙药壮西-4味散有一定的提高血Ca、P的钙剂作用，也可能是通过E2样作用补充E2，通过提高血液中的CT水平，并与其结合，在多种激素联合作用Ca、P代谢，提高BMD而达到防治骨质疏松的效果。