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蒙药壮西-4味散对维甲酸诱导大鼠骨质疏松的治疗作用

2022-07-30图布新辛颖李桂花道尔吉巴图色日道尔吉

中国老年学杂志 2022年14期
关键词:小梁成骨细胞批号

图布新 辛颖 李桂花 瑟·道尔吉巴图 色·色日道尔吉

(1内蒙古民族大学附属医院,内蒙古 通辽 028000;2蒙古国国立医科大学;3内蒙古民族大学蒙医药学院)

骨质疏松威胁着人类的生活与生存质量,是由多种因素引起的以骨密度(BMD)下降和骨微结构破坏为主要特征的系统性骨病,发病机制尚未完全阐明,骨吸收和骨形成都与之相关〔1,2〕。

蒙医对“骨枯症”的发病机制及临床表现的描述与骨质疏松相符。蒙医认为“骨枯症”是一种病因众多而复杂的全身疾病〔3,4〕,治疗以辨证施治为原则,通过健脾养胃、改善消化,促进食物的吸收是治疗骨质疏松的关键〔5〕。蒙药壮西-4味散,记载于《中国医学百科全书·蒙医卷》中,由寒水石、肉苁蓉、冰糖和地格达组方〔6〕,具有清“协日”、消食止吐、止泻等功效。目前,临床上依据蒙医理论结合现代医学评价指标,应用蒙药壮西-4治疗骨质疏松的疗效较好〔7〕。现代医学认为基础补钙是骨质疏松治疗关键,有研究发现壮西-4的单药寒水石富含硫酸钙,能够激活成骨细胞活性,增加骨保护素,促进骨吸收〔8〕。单药肉苁蓉具有一定的滋补作用,通过多通路发挥雌激素样作用而对抗骨质疏松〔9,10〕。单药地格达可作用于胃脏,保证机体清浊代谢的顺利进行。鉴于此,蒙药壮西-4可能通过补充钙离子(Ca2+)以调节骨矿物质的代谢;通过发挥雌激素样作用、增强胃脏对药物的吸收等方面治疗骨质疏松〔11,12〕。本研究通过建立维甲酸所致骨质疏松大鼠模型,观察蒙药壮西-4味散对骨质疏松的治疗作用,旨在为其进一步的临床应用提供实验依据。

1 材料和仪器

1.1实验动物 SD雌性大鼠60只,体重180~200 g,由吉林大学实验动物中心提供,合格证号:SCXK(辽)2015-0001。

1.2药物与试剂 壮西-4味散(内蒙古民族大学附属医院制剂室,批号M15060996);钙尔奇D片(德国,批号190003887);维甲酸(陕西森弗生物技术有限公司,批号SCI120308-03);Ca测试盒(南京建成生物工程研究所,批号20181221);磷(P)测试盒(南京建成生物工程研究所,批号20181227);雌激素(E2)测试盒(南京建成生物工程研究所,批号20181222);降钙素(CT)测试盒(南京建成生物工程研究所,批号20190118);碱性磷酸酶(ALP)试剂盒(浙江伊利康生物技术有限公司,批号A059-1)。

1.3主要仪器 X射线BMD检测仪(Lunar iDXA,美国GE Medical Systems Ultrasound & Primary CareDiagnostics LLC);全自动多功能酶标仪(MK3,芬兰雷勃);全自动生化分析仪(AU640,日本OLYPUS公司);组织石蜡包埋机(SYD-B,沈阳誉德电子仪器有限公司);低速自动平衡离心机(DT5-5,北京时代北利离心机有限公司);全谱直读艾离子体发射光谱仪(prodigyxp,美国俐谩公司);光学显微镜(BX51,日本OLYPUS公司)。

1.4动物分组和模型制作 雌性SD大鼠,适应性饲养1 w后,随机分为6组:正常对照组,模型组,阳性药物组和壮西-4味散低、中、高剂量组,每组10只。除正常对照组外,其余各组大鼠每天灌胃维甲酸70 mg/kg〔13〕,给药周期为14 d。给药结束后选取空白对照组和模型组大鼠,用CT扫描进行BMD分析,测定血清中ALP水平,以检测是否造模成功。模型成功后,阳性药物组给予钙尔奇D片混悬液(1.322 g/kg)、壮西-4味散低、中、高剂量组分别给予壮西-4味散(0.514 g/kg、1.056 g/kg、2.112 g/kg),正常对照组和模型组均给予蒸馏水,连续给药14 d后处死动物。

1.5主要观察指标 (1)一般情况。造模及药物治疗前后仔细观察大鼠体毛色泽、神志、四肢活动、食量增减、体重变化。(2)BMD检测。常规麻醉大鼠后使其四肢展开俯卧在X射线BMD仪的扫描床上,打开电脑终端的小动物BMD检测软件系统,进行全身BMD扫描,得到头、上肢、大腿、躯干、肋骨、脊柱、骨盆、全身的BMD,通过仪器自带软件进行大腿BMD分析。(3)尿中Ca和P测定。大鼠处死前1 d置于代谢笼中收集24 h尿液,-20℃保存待测。(4)血清指标的测定。选择腹主动脉采血,分离血清,全自动生化分析仪检测血清中Ca、P、ALP、E2和CT含量。(5)形态检查。处死动物后取其右侧的股骨,去掉附着的软组织后固定于10%甲醛溶液,固定24 h后,锯下近端1/3放入10%硝酸液中,脱Ca 6~8 h,流水冲洗2~4 h,常规脱水。按股骨的长轴包埋,用切片机沿肌长轴切片,切片厚度5 μm,苏木素-伊红(HE)染色后光镜观察。在低倍(10 × 40倍)视野下测定骨小梁面积。

1.6统计学分析 采用SPSS22.0软件行方差分析。

2 结 果

2.1大鼠一般情况 给药14 d时,正常对照组大鼠活动正常、灵活、毛色光泽,而模型组与正常对照组相比,大鼠活动明显减少,体重显著减轻〔(263.23±15.43)g vs (257.59±10.01)g,P<0.05〕,食量减少,反应迟钝体毛枯疏;阳性药物组及壮西-4味散低、中、高剂量组与模型组比较活动较多,毛色较好,体重显著增高〔(268.13±10.96)g、(266.82±11.33)g、(264.83±17.88)g、(269.30±11.33)g,P<0.05〕,与正常对照组无明显差异(P>0.05)。

2.2骨质疏松模型建立成功 与正常对照组比较,模型ALP明显增高(P<0.05),BMD显著降低(P<0.01)。见表1。结果表明骨质疏松模型造模成功。

表1 造模14 d维甲酸对大鼠血清ALP、BMD指标的影响

2.3壮西-4味散对大鼠BMD的影响 与正常对照组比较,模型组BMD显著降低(P<0.05)。与模型组比较,各给药组BMD显著增高(P<0.05),见表2。

2.4壮西-4味散对骨质疏松大鼠尿中Ca和P的影响 与正常对照组比较,模型组尿中Ca、P显著增高(P<0.05);各给药组与模型组比,Ca、P明显降低(P<0.05)。见表2。

2.5壮西-4味散对骨质疏松大鼠血清中Ca和P的影响 与正常对照组比较,模型组血清Ca、P明显降低(P<0.05);与模型组比较,阳性药物组和壮西-4味散中、高剂量组血清中的Ca、P水平均显著升高(P<0.05)。见表2。

表2 壮西-4味散对骨质疏松大鼠BMD、Ca、P、血清骨代谢因子的影响

2.6壮西-4味散对骨质疏松大鼠血清中骨代谢因子的影响 与正常对照组比较,模型组血清ALP明显增高(P<0.05),E2、CT明显降低(P<0.05);与模型组比较,阳性药物组和壮西-4味散低、中、高剂量组血清中的E2、CT均显著升高(P<0.05),ALP水平均显著降低(P<0.05)。见表2。

2.7各组股骨骨小梁面积 与正常对照组〔(52.22±1.21)%〕比较,模型组股骨骨小梁面积〔(29.79±4.95)%〕明显变小(P<0.01);与模型组比较,壮西-4味散低、中、高组和阳性药物组骨小梁面积显著增多〔(39.43±4.19)%、(45.86±4.48)%、(46.78±7.66)%、(36.87±8.06);P<0.05〕。

2.8各组股骨骨组织病理形态学 光镜下观察显示,正常对照组可见骨小梁丰富、饱满;模型组大鼠骨小梁稀少、变细;各给药组骨小梁比模型组有所增宽。见图1。

图1 各组股骨骨组织病理形态学(HE染色,×400)

3 讨 论

维甲酸又称维生素A酸,是维生素A的衍生物,可激活破骨细胞而促进骨吸收,导致BMD下降。维甲酸灌胃14 d后就即可出现骨松质和骨皮质容量明显减少,骨组织微结构的病理改变,骨小梁数量下降,骨小梁分离,骨髓腔增大,皮质骨变薄和BMD降低。采用维甲酸制作的骨质疏松实验模型所需时间短,虽然在病因上与人类骨质疏松不同,但此模型在发病症状、组织形态学表现及对E2的骨反应上与人类有较大的相似性,是大鼠急性骨质疏松的常用模型,在药物的开发研究中被普遍采用〔14〕。

BMD降低是骨质疏松的重要表现之一,因此BMD可以作为骨质疏松的评判标准之一,也可以作为评价骨质疏松疗效的客观指标。临床上双能X线BMD仪检测BMD为诊断骨质疏松的金标准〔15〕。因其测值准确且操作灵活,同样适应于实验鼠的检测〔16,17〕。

空腹尿Ca、P主要来源于骨盐的分解,故其排出量可反映骨吸收的状况,壮西-4味散可以抑制维甲酸致骨Ca流失。体内Ca、P 95%聚集在骨骼中,骨骼中Ca、P的含量受到血Ca、P、激素调节、外部补充等的影响。壮西-4味散可提高血中的Ca、P含量,可能是其属于含Ca类药物。

血清ALP含量是常用的评价骨形成和骨转换的指标。血清中ALP有50%来自于骨,骨ALP由成骨细胞分泌,而另一半绝大部分来源于肝脏。血清 ALP活性可反映成骨细胞活跃情况。壮西-4味散可以降低血清ALP,具有抑制骨吸收,降低骨转换,提高骨质量的作用。

E2可与成骨细胞上E2受体相结合,促进细胞骨保护素(OPG)表达增加,OPG是核因子κB受体活化因子(RANK)配体(RANKL)-RANK-OPG轴的重要因素,OPG不仅可以促进破骨细胞凋亡,还可以与RANKL竞争性结合RANK,抑制破骨细胞生成分化〔18,19〕。当E2缺乏时,可引起RANK/RANKL信号通路过度激活,促进破骨细胞分化,导致骨吸收增加。含E2类中药可通过类E2样作用增加骨Ca、P含量,提高BMD而达到防治骨质疏松的作用〔20〕。CT由甲状腺滤泡旁细胞产生和分泌,是参与Ca、P代谢调节的多肤类激素。其主要生理作用是降低破骨细胞的数量,抑制破骨细胞的活性,减少骨吸收;同时可抑制小肠对Ca2+的吸收,降低体内血Ca浓度,使血中游离Ca向骨组织中转化〔21〕。CT对成骨细胞具有直接作用,可以增加成骨细胞ALP的活性,促进骨的形成和矿化过程。通过对成骨细胞的调节,促进成骨细胞增殖和分化,有利于骨形成,增加BMD〔22〕。壮西-4味散可通过升高E2和CT水平达到治疗骨质疏松的作用。

骨组织强度与骨量有关,还与骨组织结构关系密切〔23〕。骨量减少是骨质疏松的主要病理变化之一,亦是引起骨质疏松骨折的一个主要原因。本实验结果显示,壮西-4味散能有效阻止维甲酸导致的骨矿物丢失和骨组织纤维结构的改变,阻止骨质量降低。

综上所述,壮西-4味散能有效升高维甲酸所致骨质疏松模型大鼠的血Ca、P,降低尿Ca、P,增加BMD,抑制骨吸收,促进骨形成,改善骨代谢的负平衡状态,对维甲酸导致的骨质疏松具有良好的治疗作用。其防治作用机制可能是蒙药壮西-4味散有一定的提高血Ca、P的钙剂作用,也可能是通过E2样作用补充E2,通过提高血液中的CT水平,并与其结合,在多种激素联合作用Ca、P代谢,提高BMD而达到防治骨质疏松的效果。

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