趋化素样因子超家族成员6与老年冠心病发生风险的相关性

张艳杰 侯树慧 王彩霞 刘鹏妹

(1包头医学院，内蒙古 包头 014030；2包头市第四医院)

相关数据显示，我国冠心病患者达1 100万例，其中以老年患者为主，且患病率和死亡率呈上升趋势〔1〕。动脉粥样硬化是心脑血管疾病的病理基础，参与冠心病的发生、发展过程〔2〕。单核细胞聚集、浸润是动脉粥样硬化的关键步骤，单核细胞在血管内膜表面黏附，之后向主动脉内皮细胞迁移，分化成巨噬细胞，最终形成泡沫细胞〔3〕。相关研究显示，趋化因子调控单核细胞的聚集活性，趋化素样因子超家族成员(CKLFSF)在其中发挥关键作用〔4〕，CKLFSF6基因是成员之一，目前关于其表达水平与老年冠心病发生风险关系的研究仍未见系统研究报道。本研究拟分析CKLFSF6与老年冠心病发生风险的相关性，并使用人主动脉内皮细胞(HAEcs)和人单核细胞(THP-1)在体外进行细胞学研究，探讨CKLFSF6在冠心病发生中的相关机制。

1 对象与方法

1.1研究对象 选取2019年3月至2020年5月在包头市第四医院行冠状动脉造影检查的老年患者158例。其中右冠脉、左前降支、左回旋支及主要分支中1支及以上狭窄程度>50% 88例为研究组，未达到上述标准的非冠心病患者70例为对照组。排除标准：合并感染性疾病、免疫性疾病、恶性肿瘤、血液系统疾病、甲状腺疾病者。纳入受试者均自愿参与本研究，签署知情同意书。

1.2材料与主要试剂 HAEcs和THP-1均购于北京诺为生物有限公司。胎牛血清、RPMI1640细胞培养基购于北京沃卡威生物有限公司；Transwells小室购于上海玉博生物有限公司；Trizol总RNA抽提试剂盒购于上海百研生物有限公司；鼠抗人血管细胞黏附因子单克隆抗体、鼠抗人E-选择素蛋白单克隆抗体、鼠抗人β-actin单克隆抗体及相应的二抗购于北京沃卡威生物有限公司。

1.3资料收集和实验室指标检测 收集患者的人口学特征及吸烟史、合并糖尿病、合并高血压情况。采集两组清晨空腹外周静脉血5 ml，取3 ml在室温条件下3 000 r/min离心10 min，分装血清和血浆，-80℃保存。采用酶联免疫吸附试验检测血清总胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白水平及血浆CKLFSF6 蛋白表达水平。取剩余的2 ml空腹外周静脉血，Trizol总RNA抽提试剂盒提取RNA，逆转录为cDNA，行荧光定量PCR反应，CKLFSF6引物序列由北京中科瑞泰生物有限公司设计、合成，CKLFSF6上游引物：5′-GAGTTGACTTAACGCTGAGTGCTGTCTCAAC-3′，下游引物：5′-TGCGTTTAAGCACTTCGAAACGACTGCTTTG-3′。β-actin上游引物：5′-TGGAGCCTGGGACGTGACCTATCGTG-3′，下游引物：5′-CAAGGTATAAACAGCATAGGTGCAC-3′。反应条件：94℃ 40 s，60℃ 30 s，95℃ 40 s，60℃ 10 s。取4 μl扩增产物行琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统检测CKLFSF6 mRNA表达水平。

1.4细胞培养 HAEcs和THP-1均接种于细胞培养瓶中，细胞密度为1×105个/瓶，使用含10%胎牛血清的RPMI1640细胞培养基，在37℃ 5%CO2的细胞培养箱中培养48 h，转入离心管中，4℃恒温2 000 r/min离心10 min，去上清后将细胞悬液混匀，按1∶3比例传代培养。

1.5细胞转染 过表达和低表达CKLFSF6腺病毒由武汉巴菲尔生物技术有限公司包装。按1×105个/孔的密度将HAEcs接种至6孔板中，37℃ 5%CO2的细胞培养箱中培养至细胞80%以上融合时转染目的质粒，转染24 h后在荧光显微镜下观察，转染效率>90%时用于后续实验。分为正常对照组(不转染，仅常规培养)、过表达CKLFSF6组(腺病毒转染过表达CKLFSF6质粒)及低表达CKLFSF6组(腺病毒转染低表达CKLFSF6质粒)。

1.6细胞迁移实验 将3组HAEcs细胞分别接种于Transwell下室，细胞数为5×104个，加入RPMI1640细胞培养液至600 μl，培养至细胞完全贴壁生长。将THP-1接种于Transwell上室，细胞数为5×104个，加入RPMI1640细胞培养液至200 μl，37℃ 5%CO2培养12 h，取出Transwell上室，10%多聚甲醛溶液固定后染色，光学显微镜下观察细胞个数。

1.7细胞黏附实验 将3组HAEcs接种至6孔板中，细胞密度为2×105个/孔，4℃ 5%CO2培养12 h，弃去细胞培养液，4℃保存备用。取THP-1适量，加入离心管中，4℃恒温2 000 r/min离心10 min，加入含10%胎牛血清的RPMI1640细胞培养液和10 mmol/L钙黄绿素，避光静置30 min，洗涤后行细胞计数。将THP-1铺于含HAEcs的6孔板中，细胞密度为2×105个/孔，避光静置2 h，弃去细胞培养液，洗涤后加入适量RPMI1640细胞培养液，荧光显微镜下观察细胞个数。

1.8Western印迹检测HAEcs中血管细胞黏附因子和E-选择素蛋白表达水平 RIPA裂解液提取3组HAEcs总蛋白，定量后十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离目标蛋白，带电湿法转膜后封闭，滴加稀释倍数为1∶300的鼠抗人血管细胞黏附因子单克隆抗体，稀释倍数为1∶500的鼠抗人E-选择素蛋白单克隆抗体，稀释倍数为1∶1 000的鼠抗人β-actin单克隆抗体，4℃过夜，滴加稀释倍数为1∶2 000的辣根过氧化物酶标记的二抗，室温反应2 h，E-Gel Imager凝胶成像分析各条带灰度值。

1.9统计学分析 采用SPSS22.0软件进行方差分析、t检验、χ2检验及多因素Logistic回归分析。

2 结 果

2.1两组人口学特征和血脂指标比较 研究组吸烟史、糖尿病、高血压比例及总胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白水平均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；两组男性比例、年龄、体重指数差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2两组CKLFSF6 mRNA和血浆蛋白表达比较 研究组CKLFSF6 mRNA表达、CKLFSF6血浆蛋白表达水平高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。见表2。

表1 两组人口学特征和临床指标比较

表2 两组CKLFSF6 mRNA和血浆蛋白表达比较

2.3老年冠心病发生风险的多因素Logistic回归分析 以老年人群中是否发生冠心病为因变量，两组比较差异有统计学意义的因素为自变量，进行多因素Logistic回归分析显示，吸烟史、糖尿病、高血压、CKLFSF6基因表达是冠心病发生的独立影响因素(P<0.05)，见表3。

2.4各组细胞迁移和黏附能力比较 过表达CKLFSF6组THP-1细胞迁移数量和黏附数量明显高于正常对照组，低表达CKLFSF6组明显低于正常对照组(P<0.01)。见表4。

表3 老年冠心病发生风险的多因素Logistic回归分析

表4 各组THP-1细胞迁移数量及HAEcs中血管细胞黏附因子、E-选择素蛋白表达水平比较

2.5各组HAEcs中血管细胞黏附因子、E-选择素蛋白表达比较 过表达CKLFSF6组血管细胞黏附因子、E-选择素蛋白表达明显高于正常对照组，低表达CKLFSF6组明显低于正常对照组(P<0.01)。见表4，图1。

1～3：正常对照组、过表达CKLFSF6组、低表达CKLFSF6组图1 Western印迹检测各组HAEcs中血管细胞黏附因子、E-选择素蛋白表达水平

3 讨 论

动脉粥样硬化是心脑血管疾病的共同病理基础，动脉血管管壁的慢性炎症反应会导致动脉粥样硬化，早期表现为血管内皮损伤、血小板聚集、血管壁单核细胞黏附聚集〔5〕。近年来研究显示，冠心病的发生与发展是遗传、环境、基础疾病等多种因素共同作用的结果，老年人是冠心病高发群体〔6〕。随着分子生物学技术和基因工程领域的快速发展，在基因层面上阐述冠心病、糖尿病、高血压、肿瘤等慢性病的发病机制已成为目前研究热点〔7,8〕。CKLFSF的研究最早出现在肿瘤领域，已得出其作为抑癌基因参与调控肿瘤细胞增殖、侵袭等过程的结论〔9〕。研究发现，CKLFSF2B基因多态性与冠心病发展密切相关〔10〕；CKLFSF5基因表达与冠心病患者介入治疗后心血管事件和血小板高反应性相关〔11〕。但目前关于CKLFSF6基因表达对冠心病发生风险的影响及相关机制研究仍十分少见。

本研究结果显示，吸烟史、糖尿病、高血压、CKLFSF6基因表达是冠心病发生的独立影响因素。烟草中含有一氧化碳、焦油、尼古丁等多种化学物质和致癌成分，对血管的刺激较大，易造成血管损伤，引发冠心病〔12〕。糖尿病患者体内长期高血糖状态会危害人体多个脏器的正常功能，其中对心、脑、肾脏的危害最明显〔13〕。长期高血压状态也会加速心脑血管病变，临床研究发现，高血压患者中冠心病发生风险较血压正常者升高约4倍〔14〕。CKLFSF6基因表达是冠心病发生的独立影响因素，提示CKLFSF6基因可能参与调控冠心病的发生与发展。本研究结果提示CKLFSF6基因过表达能够促进动脉粥样硬化的发生与进展。

血管细胞黏附因子定位于血管内皮细胞膜上，内毒素、炎症反应、细胞因子能够诱导其表达〔15〕；配体与α4β1整联蛋白结合后可促使白细胞穿过血管壁到达炎症部位，与B细胞、T细胞发生相互作用〔16〕。E-选择素主要表达于活化的内皮细胞表面，能够介导白细胞透过血管壁进入全身炎症区域，与动脉粥样硬化斑块形成、凝血过程、多发性硬化等病理过程密切相关〔17〕。本研究结果显示，CKLFSF6基因高表达可通过上调血管细胞黏附因子和E-选择素表达，促进THP-1的迁移、黏附，诱导HAEcs增殖，促进冠心病的发生与发展。本研究为CKLFSF6基因与老年冠心病发生风险关系的研究提供了新的参考依据。