宫颈癌组织程序性死亡配体-1的表达及其与患者临床病理特征、预后的关系研究

高雯 邵株燕 郑增光 孙文勇 席芸 季恩明 张慧萍 孙海燕

宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，其发病率、死亡率居高不下，尤其在发展中国家更为严重[1]，严重威胁女性健康。宫颈局部微环境免疫监视功能下降是宫颈癌发生的重要原因[2]。免疫监视是免疫系统最基本的功能之一，它可以识别、破坏、杀死或抑制突变细胞，防止肿瘤发生。因此，在宫颈癌发生、发展中，免疫微环境起至关重要的作用。程序性死亡配体-1（programmed death ligand-1,PD-L1）是一种表达于多种组织细胞表面的蛋白，它可以与T细胞上的程序性死亡受体-1（programmed death protein-1，PD-1）结合，传导免疫抑制信号，导致免疫抑制性肿瘤微环境形成，使肿瘤细胞逃避机体免疫监视和杀伤。因此阻断PD-1/PD-L1通路在理论上可以恢复肿瘤微环境内T细胞的免疫杀伤作用，从而抑制肿瘤生长[3]。且研究发现，PD-L1在多种肿瘤细胞和肿瘤组织中均有表达，过表达的PD-L1通过与PD-1结合抑制抗肿瘤免疫反应[4-5]。基于此，本研究应用免疫组织化学方法，从蛋白水平检测PD-L1在宫颈癌组织中的表达情况，并分析其与患者临床病理特征及预后的关系，以期为宫颈癌的免疫治疗提供参考，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 组织样本 选取2019年8月至2020年3月浙江省肿瘤医院收治的病理学诊断明确为宫颈癌的患者172例。纳入标准：年龄＞18岁的宫颈癌手术患者；石蜡包埋的蜡块存在足够剩余组织进行PD-L1检测。排除标准：存在其他恶性肿瘤病史；有严重或控制不稳定的躯体疾病者；妊娠或哺乳期妇女。通过医院信息管理系统，获取患者临床病理特征资料，包括年龄、身高、体重、BMI、生育史、家族史、术前实验室检查指标、影像学检查指标等以及病理报告中关于肿瘤分期、有无淋巴转移和血管侵犯等资料，收集患者术后随访资料。本研究经浙江省肿瘤医院医学伦理委员会批准，批件号：IRB-[2020]9号。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂和仪器 PD-L1抗体试剂（克隆号：WD160）和DAB染色液试剂盒均为苏州药明泽康生物科技有限公司产品。免疫组织化学试剂盒、柠檬酸抗原修复液购自上海威奥生物科技有限公司。凝胶成像系统购自美国Bio-Rad公司；数码相机购自日本Canon公司；光学显微镜购自日本Olympus公司。

1.2.2 宫颈癌组织PD-L1表达情况检测 采用免疫组织化学法。将石蜡包埋的宫颈癌组织蜡块连续切片，厚2 μm，放置于载玻片上。脱蜡、水化后采用柠檬酸钠缓冲溶液进行微波抗原修复，血清封闭抗体，PD-L1一抗（稀释浓度为1∶50）4℃孵育过夜，PBS清洗后，二抗（稀释浓度为1∶50）室温孵育1 h，再次PBS清洗后，采用DAB染色液染色并封片。已知PD-L1表达阳性切片作为阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。由2位病理科医师双盲阅片，评估染色需在低倍、高倍镜下观察。每张切片随机选取3个视野，采用目镜20倍、物镜10倍放大视野，每个视野记数100个肿瘤细胞。宫颈癌组织PD-L1表达情况采用联合阳性分数（combined positive score,CPS）评估，计算公式：CPS=（PD-L1阳性细胞/可计数肿瘤细胞）×100。CPS≥1为PD-L1表达阳性，＜1为PD-L1表达阴性。PD-L1阳性细胞为：任何染色强度下具有完全或部分细胞膜染色而非仅有细胞质染色的肿瘤细胞；任何染色强度下，位于肿瘤巢内或相邻的滋养基质内表现为细胞膜染色和（或）细胞质染色的直接与肿瘤反应的淋巴细胞和巨噬细胞。

1.3 统计学处理 采用SPSS 20.0统计软件。正态分布的计量资料以表示，组间比较采用两独立样本t检验；非正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，组间比较采用Mann-WhitneyU检验；计数资料以频数和构成比表示，组间比较采用χ2检验。影响因素分析采用多因素logistic回归分析。采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，两组患者生存曲线的比较采用log-rank检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 宫颈癌组织PD-L1表达情况 172例宫颈癌患者中PD-L1表达阳性166例，阳性表达率为96.51%。PD-L1主要表达于细胞质。宫颈癌组织PD-L1表达阳性、阴性病理切片分别见图1、2（插页）。

图1 宫颈癌组织程序性死亡配体-1（PDL1）表达阳性（免疫组织化学染色，×200）

图2 宫颈癌组织程序性死亡配体-1（PDL1）表达阴性（免疫组织化学染色，×200）

2.2 宫颈癌组织PD-L1表达情况与患者临床病理特征的关系分析 宫颈癌组织PD-L1表达阳性与高危型HPV感染、CA19-9水平、病理类型、分化程度均有关（均P＜0.05），与患者年龄、怀孕次数、分娩次数、BMI、家族史、Hb水平、血清鳞状细胞癌抗原、癌胚抗原、CA125、初始治疗方式、肿瘤生长类型、肿瘤大小、淋巴结转移、脉管瘤栓、器官转移、肿瘤分期、合并其他癌症等均无关（均P＞0.05）。宫颈癌组织PD-L1表达阳性患者与阴性患者临床病理特征比较见表1。

表1 宫颈癌组织PD-L1表达阳性患者与阴性患者临床病理特征比较

2.3 患者宫颈癌组织PD-L1表达阳性的影响因素分析 多因素logistic回归分析显示，病理类型是患者宫颈癌组织PD-L1表达阳性的独立影响因素（P＜0.05），见表2。

表2 患者宫颈癌组织PD-L1表达阳性的影响因素logistic回归分析

2.4 宫颈癌组织PD-L1表达情况与患者预后的关系分析 患者术后随访4～46个月，中位随访时间28个月。随访期内共有24例患者复发，PD-L1表达阳性、阴性患者中分别有21例（12.7%）、3例（50%）；共有13例患者死亡，PD-L1表达阳性、阴性患者中分别有11例（6.6%）、2例（33.3%）。宫颈癌组织PD-L1表达阳性、阴性患者2年无进展生存率分别为88.6%、50.0%，2年总生存率分别为96.4%、66.7%，宫颈癌组织PD-L1表达阳性患者2年无进展生存率、2年总生存率均高于PD-L1表达阴性患者（均P＜0.05），见图3、4。

图3 宫颈癌组织PD-L1表达阳性与表达阴性患者无进展生存曲线比较

图4 宫颈癌组织PD-L1表达阳性与表达阴性患者总生存曲线比较

3 讨论

宫颈局部微环境免疫监视功能下降及免疫逃逸现象的产生在宫颈癌的发生、发展中起重要作用。研究表明，PD-L1在宫颈癌中高表达，且参与宫颈癌的发生、发展，在肿瘤的免疫逃逸中起到了重要作用[6-10]。PD-L1与其受体PD-1结合后，导致肿瘤抗原特异性T细胞凋亡或免疫无能，从而抑制免疫反应，促使肿瘤细胞逃逸。因此，PD-L1的表达情况对宫颈癌发生、发展及预后都有重要影响。研究发现，PD-L1在正常宫颈、宫颈上皮内瘤变和宫颈癌组织中的表达逐渐上调，同时，PD-L1蛋白表达在不同FIGO分期，不同肿瘤大小，不同分化程度中表达不同[11]。本研究结果表明PD-L1在宫颈癌组织中的阳性表达率为96.51%，但未发现其与肿瘤分期的相关性，原因可能与本研究样本量较小有关。本研究结果还显示，PDL1的表达情况与高危型HPV感染状态、CA19-9水平、病理类型和分化程度有关。

本研究宫颈癌组织PD-L1表达阳性患者与表达阴性患者相比，高危型HPV感染的比例较高、CA19-9升高的比例较低，鳞癌比例较高，且中低分化比例较高。既往研究显示，PD-L1的表达受HPV调控，HPV E5/56/E7可激活PI3K/Akt、MAPK、STAT/NF-κB通路调控PD-L1/PD-1轴促进宫颈癌发生、发展[12]。然而，近期有研究通过免疫组织化学法检测了HPV相关和HPV不相关的宫颈腺癌患者中PD-L1的表达，发现两组之间并无统计学差异[13]。该团队还进一步研究HPV相关宫颈腺癌时发现，PD-L1的表达在携带不同亚型的HPV患者中同样无统计学差异。本研究结果提示，PD-L1表达阳性患者2年无进展生存率和2年总生存率均高于表达阴性患者。这可能是因为PD-L1表达阳性患者基本都是鳞癌，而PD-L1表达阴性患者基本都是腺癌或其他类型，而在宫颈癌中鳞癌预后较好。

PD-L1作为PD-1/PD-L1免疫抑制剂的作用靶点，对从肿瘤患者中筛选获益群体具有积极意义。本研究发现，PD-L1在宫颈癌的各临床病理特征中有不同的表达，宫颈鳞癌表达最高，而PD-L1表达越高，患者从PD-1/PD-L1免疫抑制剂治疗中获益可能性越高。然而，目前对于PD-L1表达水平与宫颈癌临床病理特征，以及与患者使用PD-1/PD-L1免疫抑制剂的药效相关性的研究不多，临床病理特征中PD-L1表达水平高的群体是否普遍受益有待进一步研究。