Brusatol去羟甲基化修饰抑制IDH1-α-KG-TET1-Nrf2信号通路逆转I型子宫内膜癌孕激素耐药研究

田淑娜 胡美燕 张箴波 陈雄 陈琪珍

子宫内膜癌是女性生殖系统常见的三大恶性肿瘤之一，根据美国癌症协会数据统计，2020年美国子宫内膜癌新发65 620例，死亡12 590例，子宫内膜癌患者新增人数远大于宫颈癌、卵巢癌，死亡人数仅次于卵巢癌[1-2]。子宫内膜癌根据其病理特点及临床表现分为Ⅰ和Ⅱ型。Ⅰ型即雌激素依赖型，常见于50～60岁妇女，是由于长期无孕激素拮抗的雌激素过度刺激有关，对孕激素治疗效果好，大部分由子宫内膜增生尤其是不典型增生形成，肿瘤分化程度高、预后好[3]。Ⅱ型即非雌激素依赖型，多发生于萎缩性子宫内膜，肿瘤分化程度低，预后差。对于年轻有生育需求的早期子宫内膜癌患者以及晚期、转移或复发的子宫内膜癌患者，孕激素是目前子宫内膜癌保守治疗的重要药物。但部分患者存在孕激素耐药现象，严重影响子宫内膜癌保守治疗的效果，因此临床采用孕激素保守治疗子宫内膜癌需谨慎评估[4]。本课题组前期研究发现，核转录因子E2相关因子（nuclear factor erythroid related factor 2,Nrf2）和异柠檬酸脱氢酶1（isocitrate dehydrogenase 1,IDH1）在子宫内膜癌组织中的表达水平显著高于正常增殖期子宫内膜组织。Nrf2高表达促进孕激素耐药的发生，而下调Nrf2可增加子宫内膜癌对孕激素的反应性。IDH1是三羧酸循环中的一种重要酶，其功能是将异柠檬酸氧化脱羧转化为α-酮戊二酸（α-ketoglutarate,α-KG）。TET1蛋白是α-KG依赖的双加氧酶，它可以催化5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine,5-mC）转化为5-羟甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine,5-hmC），是DNA去甲基化过程中一种重要的酶，对于维持干细胞的多能性有重要作用。IDH1的突变可导致TET1不能使5-mC转化为5-hmC。IDH1-α-KG-TET1-Nrf2信号通路可能与Ⅰ型子宫内膜癌孕激素耐药发生机制有关[5]。本课题组前期研究也发现中草药提取物鸦胆子苦醇Brusatol能抑制子宫内膜癌细胞增殖和活性[6]。文献报道，Brusatol能抑制包括子宫内膜癌在内的癌症中Nrf2的表达，Nrf2通过下游靶基因AKR1C1介导的孕激素调控导致孕激素耐药，促进子宫内膜癌发生[7-8]。本研究旨在通过动物实验探讨Brusatol能否抑制Ⅰ型子宫内膜癌逆转孕激素耐药及其作用机制，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 主要材料 子宫内膜癌细胞系Ishikawa细胞由上海市第一人民医院妇产科实验室提供。NU/NU裸鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，均为雌性，鼠龄 6～8周，重20～24 g。小鼠均在无特定病原体（SPF）条件下饲养。Brusatol、醋酸甲羟孕酮（medroxyprogesterone acetate,MPA）购自美国Sigma公司，IDH1、α-KG、TET1单克隆抗体均购自美国Sigma公司，Nrf2购自美国Santa公司，5-hmC抗体购自美国Active Motif公司，CCK-8试剂盒购自德国Millipore公司，DMEMF12培养基、FBS均购自美国Gibico公司，青霉素和链霉素购自中国赛默飞世尔公司，Western blot一抗稀释液、Western blot二抗稀释液、胰蛋白酶、BCA蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天生物科技有限公司，RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂-磷酸酶抑制剂购自美国Thermo Scientific有限公司，DNA提取试剂盒购自德国QIAGEN公司，ECL化学发光剂购自德国Millipore公司。

1.2 细胞培养 Ishikawa细胞用含10%FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的DMEM-F12培养基在湿化的、含5%二氧化碳、37℃的环境下进行培养，对原代Ishikawa细胞进行分离和培养。

1.3 子宫内膜癌裸鼠移植瘤模型的建立和处理

1.3.1 子宫内膜癌裸鼠移植瘤模型的建立 将Ishikawa细胞移植至20只裸鼠。在无菌条件下，待Ishikawa细胞生长至对数期，使用一次性1 ml无菌注射器抽取Ishikawa细胞悬液（0.25%胰酶消化后配成），注射于裸鼠右侧腋下皮下组织，每只裸鼠注射细胞悬液200 μl（约含1×107个细胞），移植后1周左右可见肿瘤生长。

1.3.2 模型祼鼠的分组和处理 在裸鼠移植Ishikawa细胞2周后，肿瘤长径达到0.5～1 cm，将20只裸鼠按随机数字表法分为4组，每组5只。空白对照组、Brusatol组、MPA组、Brusatol+MPA组裸鼠分别经腹腔注射0.1 ml 0.9%氯化钠注射液、2 mg/kg Brusatol、100 mg/kg MPA、2 mg/kg Brusatol+100 mg/kg MPA，均为3次/周，共9次。

1.4 裸鼠移植瘤抑制率观察 4组裸鼠移植Ishikawa细胞后每3 d测量1次裸鼠皮下移植瘤的长径a和短径b。肿瘤体积=a×b2×0.52。用药干预3周后，采用颈椎脱臼法处死4组成瘤裸鼠，所有移植瘤均位于裸鼠的右侧腋下皮下，呈卵圆形突起，表面皮肤光滑完整，大部分移植瘤包膜完整，与瘤体周围组织薄膜状粘连，质地较韧，容易整体剥离。超净手术操作台上切开右侧腋下皮下组织，完整剥出移植瘤，计算肿瘤抑制率。肿瘤抑制率=（空白对照组肿瘤体积-实验组肿瘤体积）/空白对照组肿瘤体积×100%。

1.5 Ishikawa细胞提取 从-80℃冰箱中取出4组裸鼠移植瘤组织，置于冰袋上，使用消毒的剪刀剪取适宜大小的组织块，称取25 mg组织于冰袋上剪碎，置于预冷的匀浆器中，加入500 μl预冷的PBS，于冰浴中碾碎组织，用剪去尖端的1 ml tip头吸取组织液于1.5 ml的EP管中，置于冰盒上，再加500 μl的预冷的PBS于匀浆器，把残余的组织进一步收集于同一EP管中，Ⅰ型胶原酶消化，置于37℃、5%二氧化碳环境持续3 h；反复吹打培养皿中的颗粒样组织并移至15 ml离心管，1 000 r/min离心5 min，用RPMI 1640完全培养基重悬细胞后分别以100、40 μm滤网过滤；滤过40 μm滤网的为子宫内膜间质细胞，直径介于40～100 μm为Ishikawa细胞，使用10%FBS稳定滤过目标细胞得到Ishikawa细胞。

1.6 4组移植瘤组织IDH1-α-KG-TET1-Nrf2信号通路相关蛋白表达水平检测 同前处理裸鼠移植瘤组织后，采用Western blot法，用RIPA裂解缓冲液提取各组总蛋白。BCA测定蛋白质浓度后，将提取的组织总蛋白中加入等体积2×SDS混匀，100℃持续10 min，将蛋白质完全变性，置于-20℃保存。将50 μg蛋白质装载到SDS聚丙烯酰胺凝胶中，电泳并转移到PVDF膜上，然后分别与针对IDH1、α-KG、TET1、Nrf2的一抗4℃孵育过夜。将PVDF膜置于5%脱脂奶粉（TBST配制）中进行封闭1 h。洗膜后室温下孵育对应的二抗1 h，使用化学发光检测系统（曝光液A、B等体积混合）检测蛋白表达情况。每个实验重复3次。

1.7 4组Ishikawa细胞增殖能力检测 采用CCK-8法。将各组Ishikawa细胞以105个细胞/ml的密度接种于96孔细胞培养板，将足量的细胞混悬液加入到10 cm的细胞皿中，用排枪轻柔吹打混匀后快速进行接种，每孔100 μl，每接种1排孔就再次用排枪轻柔吹打细胞混悬液以保证细胞种板均匀。将种植好的细胞放入培养箱中培养，细胞贴壁后，用排枪小心并均匀地向每个待测孔中加入10 μl CCK-8溶液。放入培养箱中培养1～4 h。酶标仪测定其在450 nm处的光密度（OD值）以反映细胞增殖能力。

1.8 4组Ishikawa细胞TET1羟甲基化水平检测 采用Dot blot法。4组Ishikawa细胞以1×104个细胞/孔的浓度接种在6孔板中，并培养至95%的融合度时取出细胞，用PBS清洗1～2次，吸尽残余的PBS，加入胰酶消化，待完全消化后，迅速加入完全培养基消化，吸入1.5 ml离心管中，再次使用PBS清洗，直至胰酶完全被清除。按试剂盒说明书提取细胞DNA。将提取DNA滴在硝酸纤维素膜上。80℃下烘焙10 min后，用10%脱脂牛奶封闭膜1 h，然后在4℃下与5-hmC一抗孵育过夜。PBS洗3次，5 min/次，放入稀释好的二抗中，室温下孵育1 h。ECL化学发光液显影，将ECL显影后的条带使用美蓝染色1～2 s，立即将条带放摇床上用清水清洗，以美蓝染色的结果作为内参照。

1.9 统计学处理 采用SPSS 25.0统计软件。计量资料以表示，多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。计数资料以频数和构成比表示，组间比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4组裸鼠肿瘤抑制率比较 Brusatol组、MPA组、Brusatol+MPA组裸鼠肿瘤抑制率分别为（30.24±1.52）%、（50.37±2.36）%、（72.56±3.82）%，Brusatol+MPA组＞MPA组＞Brusatol组＞空白对照组，4组裸鼠肿瘤抑制率比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 4组移植瘤组织IDH1、α-KG、TET1、Nrf2蛋白表达水平比较 Brusatol+MPA组IDH1、α-KG、TET1、Nrf2蛋白表达水平均低于MPA组、Brusatol组、空白对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；MPA组、Brusatol组蛋白水平低于空白对照组，两组差异有统计学意义（P＜0.05）；MPA组与Brusatol组蛋白表达水平比较差异无统计学意义（均P＞0.05）。见图1、表1。

图1 4组移植瘤组织IDH1、α-KG、TET1、Nrf2蛋白表达电泳图

表1 4组移植瘤组织IDH1、α-KG、TET1、Nrf2蛋白表达水平比较

2.3 4组Ishikawa细胞增殖能力比较 Brusatol+MPA组Ishikawa细胞增殖能力均低于MPA组、Brusatol组、空白对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；MPA组、Brusatol组细胞增殖能力均低于空白对照组，差异有统计学意义（均P＜0.05）；MPA组细胞增殖能力弱于Brusatol组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

图2 4组Ishikawa细胞增殖能力比较

2.4 4组Ishikawa细胞TET1羟甲基化水平比较 Brusatol+MPA组Ishikawa细胞TET1羟甲基化水平均低于MPA组、Brusatol组、空白对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；MPA组、Brusatol组TET1羟甲基化水平均低于空白对照组，差异有统计学意义（均P＜0.05）；MPA组TET1羟甲基化水平低于Brusatol组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图3。

图3 4组Ishikawa细胞TET1羟甲基化水平Dot blot检测显影图

3 讨论

子宫内膜癌为女性生殖系统常见肿瘤之一，近年来，由于生活环境、工作压力等因素的影响，子宫内膜癌发病率逐年增加，同时有年轻化趋势。对于部分育龄期女性，有强烈保留生育功能的意愿，这使子宫内膜癌患者的保守治疗受到临床医疗界的广泛关注。孕激素治疗是保留生育功能的重要治疗方式[9]。MPA是子宫内膜癌患者保守治疗中最常见的孕激素，但是大约30%的患者对孕激素治疗敏感性较低，甚至耐药，最终致使保守治疗失败。虽然国内外学者对孕激素耐药进行了大量研究，但仍不能明确其具体机制，目前尚无有效的治疗策略克服孕激素耐药。基于国内外学者的研究及本课题组的前期工作，Nrf2和IDH1在子宫内膜癌组织中表达水平显著高于正常增殖期子宫内膜组织，IDH1-α-KG-TET1-Nrf2信号通路可能与Ⅰ型子宫内膜癌孕激素耐药机制有关。Brusatol为中草药提取物，具有清热、解毒、降糖、抗肿瘤等作用[10]，研究发现Brusatol能抑制白血病细胞及肺癌细胞的生长[11-12]，本课题组也发现Brusatol能抑制子宫内膜癌细胞增殖和活性[13]。本课题组拟进一步验证Brusatol可以通过抑制IDH1-α-KG-TET1-Nrf2信号通路相关蛋白的表达，提高子宫内膜癌组织对孕激素治疗的敏感性，以发掘预测和影响子宫内膜组织激素敏感性的生物标志物，指导临床合理开展激素治疗及寻求逆转孕激素耐药的药物提供理论依据。

研究表明IDH1在非小细胞肺癌中表达显著上调，并存在于血浆中；IDH1可以作为诊断非小细胞肺癌的血清生物标志物，具有较高的灵敏度和特异度[14]。本研究结果表明，IDH1与子宫内膜癌的发展有关，并可能作为早期诊断的生物标志物。α-KG是IDH1酶活性的重要产物，在IDH1诱导的信号通路中发挥多种作用。肿瘤进展的内在特征之一是α-KG水平的波动，它可能通过触发选择性压力下的生物能量变化来促进肿瘤的发生。TET1蛋白是α-KG依赖的双加氧酶，它可以催化5-mC转化为5-hmC，是DNA去甲基化过程中一种重要的酶，对于维持干细胞的多能性有重要作用。近年来，国内外许多研究发现TET1可以增加基因组5-hmC的表达来抑制多种癌症的发生或进展，因此国内外学者普遍认为TET1是一种抑癌基因[15]。TET1对5-hmC的调控在子宫内膜癌及其他癌症中起重要作用。有研究发现TET1与子宫内膜癌的进展相关，并且可以作为判断子宫内膜癌预后的一个独立危险因素[16-17]。转染IDH1质粒后，TET1在子宫内膜癌细胞中的表达增强。Nrf2与多种疾病及肿瘤发生、发展相关，如白血病、肺癌、胰腺癌和脑肿瘤，Nrf2能调控其下游靶基因的表达水平，这些靶基因参与多种肿瘤耐药。在子宫内膜癌治疗中，孕激素抵抗与转录因子Nrf2密切相关，Nrf2高表达促进孕激素耐药的发生，而下调Nrf2可增加子宫内膜癌对孕激素的反应性[18]。

Yu等[19]研究发现，Brusatol可通过调节不同信号通路，如Akt/mTOR/Nrf2等信号通路，对非小细胞肺癌、肠癌、乳腺癌等发挥抗肿瘤作用，改善化疗耐药性或放疗耐药性。孙翟等[20]研究表明目前子宫内膜癌保守治疗最佳的策略是大剂量的孕激素治疗，而对孕激素的敏感性及是否产生耐药是影响最终治疗效果的关键因素。本研究Western blot检测结果也证实Brusatol和MPA抑制子宫内膜癌细胞IDH1-α-KG-TET1-Nrf2信号通路相关蛋白的表达。CCK-8法检测结果发现单独的Brusatol和孕激素均能抑制子宫内膜癌细胞的生长，联合使用Brusatol和孕激素对子宫内膜癌细胞生长的抑制作用更强。Bai等[5]研究发现全面了解IDH1-α-KG-TE1-Nrf2信号传导通路可能为预防子宫内膜癌进展提供新的治疗线索。本研究Dot blot检测结果显示，转染Nrf2或IDH1或α-KG均提高了TET1催化5-hmC水平，而Brusatol抑制TET1的5-hmC，这说明Brusatol可通过去羟甲基化修饰抑制IDH1-α-KGTET1-Nrf2信号通路提高子宫内膜癌对孕激素治疗的敏感性、缓解孕激素抵抗。Xiang等[21]研究表明，在裸鼠胰腺癌模型中，Brusatol可通过抑制Nrf2途径并增加活性氧的积累，显著抑制裸鼠胰腺肿瘤的生长。本研究也发现，接种Ishikawa细胞的裸鼠经Brusatol处理后肿瘤生长减慢，支持Brusatol能抑制子宫内膜癌细胞生长的作用，同时联合使用Brusatol和MPA可增强子宫内膜癌对孕激素治疗的敏感性、逆转孕激素耐药。

综上所述，Brusatol可通过下调IDH1-α-KGTET1-Nrf2信号通路相关蛋白的表达逆转Ⅰ型子宫内膜癌的孕激素耐药性。这为临床合理开展孕激素治疗子宫内膜癌及寻求逆转孕激素耐药的药物提供了理论参考。