白细胞介素38在肾细胞癌中的表达水平及其与临床病理特征的关系

陈锐 熊壮 陈仁富

1徐州医科大学附属医院泌尿外科（江苏 徐州 221000）；2徐州医科大学研究生院（江苏 徐州 221002）

肾细胞癌（renal cell carcinoma，RCC）是一种起源于肾小管和集合管上皮细胞的恶性肿瘤，约占肾恶性肿瘤的80%～90%［1］。临床上主要通过手术切除治疗RCC，但流行病学调查显示约30%RCC患者在首次就诊时已发生远处转移，且有10%～28%的RCC 患者在术后仍会出现转移［2-3］。因此，积极寻找早期诊断RCC 的生物标志物，对于指导患者的临床治疗及改善预后具有重要意义。白细胞介素-1（Interleukin-1，IL-1）家族是一类能够影响肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）进而导致肿瘤细胞逃逸宿主免疫细胞对其杀伤作用的重要调节因子，在肿瘤进展中发挥关键作用［4-5］。研究业已表明，IL-1 家族成员如IL-18、IL-37、IL-33、IL-1β 等均参与RCC 的发生发展，并且与RCC患者的生存预后密切相关［6-9］。IL-38 是新发现的一种IL-1 家族成员，在TME 中能够发挥抑制炎症的作用，参与肿瘤的发生、发展、恶性转化、浸润和转移［10］。基于此，本研究探讨了IL-38 在RCC 中的表达水平，并分析其与RCC 患者临床病理特征之间的关系，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象前瞻性选取2019年9月至2021年6月徐州医科大学附属医院泌尿外科住院的78 例行腹腔镜肾癌根治性切除术的肾透明细胞癌患者作为肾癌组，其中男43 例，女35 例，年龄平均（57.12±10.91）岁。收集其临床资料，血液及肿瘤和癌旁组织标本，癌旁组织为癌灶周2 cm 以外正常肾组织，并经病理证实无癌细胞浸润。纳入标准：（1）经病理诊断为肾透明细胞癌患者；（2）均为初诊初治患者，术前均未行化疗、放疗、免疫靶向治疗及手术治疗；（3）临床资料完整；（4）均签署知情同意书。排除标准：（1）合并其他恶性肿瘤；（2）合并其他自身免疫性疾病；（3）存在全身感染性疾病者；（4）存在其他肾脏器质性疾病者。另外，选择同时期的60 例来我院体检的健康志愿者作为对照组，其中男32 例，女28 例，年龄平均（54.10 ±11.81）岁。两组受试者的性别、年龄相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究经徐州医科大学附属医院伦理委员会批准，所有研究对象均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清IL-38水平肾癌组对象均于入院第2 天清晨空腹抽取3 mL 不抗凝静脉血，水平离心机2 500 r/min 离心10 min，收集上层血清，-80 ℃保存待测。采用人IL-38 ELISA 试剂盒（美国R&D 公司）检测研究组及对照组血清中IL-38 水平，所有操作步骤严格按照说明书介绍的方法进行。

1.2.2 流式细胞术检测外周血单个核细胞（PBMC）中Treg 和Th17 细胞表达采集所有研究对象5 mL 抗凝静脉血，采用人淋巴细胞分离液（天津灏洋生物公司）通过密度梯度离心法分离得到PBMC，一部分PBMC 经PBS 洗涤离心后加入鼠抗人CD4-FITC 抗体，鼠抗人CD25-PE 抗体，鼠抗人CD127-Alexa Fluor 647抗体（美国BD公司），同时设同型对照管，室温避光孵育30 min 后，采用LSRF ortessa型流式细胞仪（美国BD公司）检测Treg细胞，其表型为CD4+CD25+CD127-。另一部分PBMC 加入2 μL Leukocyte Activation Cocktail，with BD GolgiPlug刺激剂（美国BD 公司），37 ℃细胞培养箱内孵育6 h；流式管收集细胞，加入鼠抗人CD4-BV421 抗体（美国BD 公司），室温避光孵育30 min 后加入固定破膜液固定细胞10 min，洗涤离心后加入5 μL鼠抗人IL-17A-PE 抗体（美国BD 公司），室温避光孵育30 min后，采用LSRF ortessa型流式细胞仪（美国BD公司）检测Th17细胞，其表型为CD4+IL-17A+。

1.2.3 实时荧光定量PCR 法（qPCR）检测IL-38 mRNA 水平Trizol 法提取肾癌组织及癌旁组织中总RNA，并将总RNA 逆转录为cDNA，qPCR 检测肾癌组织及癌旁组织中IL-38 mRNA 水平。qPCR 序列如下，IL-38 上游5′-TTATCCTTGTGGGCTCAGTT-3′，下游5′-AATCCGTTCCCTTGGCTTTT-3′；GAPDH 上游5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下游5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。

1.3 统计学方法采用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析。符合正态分布的计量资料采用均数±标准差表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析；计数资料用例（%）表示，组间比较采用χ2检验；绘制ROC 曲线并计算IL-38诊断肾癌的敏感度、特异度及ROC 曲线下面积（AUC）。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 健康对照组和肾癌组血清IL-38 表达水平比较肾癌组血清中IL-38 为（107.44±37.84）pg/mL，健康对照组为（174.22 ± 49.34）pg/mL，两组间比较差异有统计学意义（t=9.001，P＜0.001），见图1。

图1 两组血清IL-38 的表达水平Fig.1 Serum IL-38 expression levels in the two groups

2.2 不同临床病理特征肾癌患者血清IL-38 水平的比较不同年龄及性别患者血清中IL-38 水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）；不同肿瘤TNM分期、有无淋巴结转移、Fuhrman 分级及肿瘤大小患者的IL-38 水平比较差异有统计学意义（P＜0.001），见表1。

表1 IL-38 表达水平与肾癌患者临床病理特征之间的关系Tab.1 The relationship between IL-38 expression level and clinicopathological features of renal cancer patients ±s

表1 IL-38 表达水平与肾癌患者临床病理特征之间的关系Tab.1 The relationship between IL-38 expression level and clinicopathological features of renal cancer patients ±s

项目性别例数血清IL-38（pg/mL）t 值-0.354 P 值0.724男 女43 35 106.07±35.47 109.13±41.02年龄＜60 岁≥60 岁TNM 分期-1.689 0.095 36 42 99.72±38.21 114.06±36.68 15.876＜0.001ⅠⅡⅢⅣ40 20 14 4 126.73±32.87 103.19±27.40 74.59±28.04 50.84±12.15淋巴结转移是 否13 65 72.74±30.91 114.38±35.35 3.951＜0.001 Fuhrman 分级Ⅰ-ⅡⅢ-Ⅳ肿瘤大小＜4.0 cm 4.0～6.9 cm＞7.0 cm 5.685＜0.001 53 25 121.55±32.82 77.55±29.82 20.345＜0.001 25 33 20 131.83±30.83 109.84±31.67 73.01±29.52

2.3 血清IL-38 水平对肾癌的诊断价值ROC 曲线分析显示血清IL-38 为150.65 pg/mL 时，预测诊断肾癌的曲线下面积为0.863，灵敏度为71.7%，特异度为87.2%，见图2。

图2 血清IL-38 水平对于诊断肾癌的ROC 曲线Fig.2 ROC curve of serum IL-38 level for diagnosis of renal cancer

2.4 癌旁组织和肾癌组织中IL-38 mRNA 的表达肾癌组织中IL-38 mRNA 的表达水平低于癌旁组织，差异具有统计学意义（P＜0.001），且随肿瘤分期增加呈递减趋势，见图3。

图3 不同病理分期肾癌组织及癌旁组织中IL-38mRNA水平Fig.3 IL-38 mRNA levels in renal carcinoma tissues and adjacent tissues at different pathological stages

2.5 健康对照组和肾癌组外周血Treg和Th17细胞表达水平比较两组外周血Treg 细胞、Th17 细胞流式细胞术设门图见图4A、B。肾癌组外周血中Treg 细胞表达水平为（3.23 ± 1.82）%，健康对照组为（5.26 ± 1.56）%，两组间比较差异有统计学意义（t=6.909，P＜0.001），见图4C。肾癌组外周血中Th17 细胞表达水平为（2.94 ± 1.54）%，健康对照组为（1.87 ± 0.71）%，两组间比较差异有统计学意义（t=-5.444，P＜0.001），见图4D。

图4 两组外周血Treg 细胞和Th17 细胞百分率比较Fig.4 Comparison of the percentage of Treg cells and Th17 cells in peripheral blood between the two groups

2.6 肾癌组手术前后外周血Treg、Th17 细胞表达水平和血清IL-38 水平的比较肾癌组术前、术后Treg 细胞、Th17 细胞流式细胞术设门图见图5A、B。对78 例肾癌患者进行1 个月的术后随访，失访21例，最终共计纳入57 例肾癌患者。57 例肾癌患者术后外周血Treg 细胞表达水平为（4.51 ± 1.79）%，术前外周血Treg 细胞表达水平为（3.51 ± 1.65）%，差异有统计学意义（t=-12.79，P＜0.001），见图5C；57 例肾癌患者术后外周血Th17 细胞表达水平为（1.42 ± 0.99）%，术前外周血Th17 细胞表达水平为（2.57 ± 1.55）%，差异有统计学意义（t=10.309，P＜0.001），见图5D；57 例肾癌患者术后血清IL-38水平为（139.18 ± 44.07）pg/mL，术前血清IL-38 水平为（111.71 ± 37.65）pg/mL，差异有统计学意义（t=-9.981，P＜0.001），见图5E。

图5 肾癌患者手术前后外周血Treg、Th17 细胞表达水平和血清IL-38 水平Fig.5 Expression levels of Treg and Th17 cells in peripheral blood and serum IL-38 levels in patients with renal cancer before and after surgery

3 讨论

肾细胞癌是泌尿系统最为常见的一种恶性肿瘤，其起病隐匿、多变，患者临床症状多不典型，绝大数患者初次就诊时已处于肿瘤的中晚期，往往错过最佳的治疗时机，导致患者预后较差［11-12］。流行病学调查显示，我国肾癌发病率呈逐年上升趋势，且发病年龄越来越年轻化，若不早发现、早诊断、早治疗，将严重降低患者生活的质量并且导致患者预后不佳［13］。手术切除是治疗肾癌的主要方案，但多数患者在首次就诊时已发生局部进展或者远处转移，导致手术难度加大，治疗手段局限匮乏，且部分患者术后仍会出现术后转移，严重影响患者的生存预后［14-15］。因此，寻找新的能够早期筛查肾癌的生物标志物对于提高患者的临床治疗效果及预后有着极其重要的临床意义。

IL-38 是新发现的IL-1 家族成员，因其在炎症进程中发挥关键的抗炎作用，近年来其在肿瘤、自身免疫病等疾病中所扮演的角色越来越受关注［16-18］。IL-38 与多种肿瘤疾病具有相关性，如宫颈癌、胃癌及肺癌等均发现IL-38 的表达［19-21］。基于此，本研究比较了IL-38 在肾癌患者血清中的表达水平，发现肾癌患者血清中IL-38 表达水平明显降低，提示IL-38 可能参与肾癌的发病。此外，本研究还发现血清IL-38 水平与肿瘤分期、分级、淋巴结转移及肿瘤大小密切相关，而肿瘤分期、分级、淋巴结转移及肿瘤大小是评估肾癌患者预后的重要指标，所以本研究结果也间接提示肾癌患者血清中IL-38 水平可以在一定程度反映患者的预后。同样在肾癌组织中也发现IL-38 mRNA 水平表达降低，且随肿瘤分期增加呈递减趋势。然而，临床上通过肾脏穿刺活检检测IL-38 mRNA 存在一定的困难，考虑到血清IL-38 检测的便捷性，因此建议早期行血液学检测。为此本研究进一步绘制了ROC 曲线，发现肾癌患者血清中IL-38 截点为150.65 pg/mL 时，曲线下面积为0.863，在诊断方面，其灵敏度为71.7%，特异度为87.2%，具有较好的敏感度和特异度。

研究发现，IL-38 能够抑制Toll 样受体介导的NF-κB 和MAPKs 炎症通路，从而影响哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）激活，进而导致Th17 细胞分化的关键环节STAT3 通路磷酸化水平受到抑制，减少Th17 细胞转录子RORγt 生成，最终抑制Th17 细胞产生和分化［22-23］。巨噬细胞作为维持免疫微环境平衡的关键调控者，另一项研究表明IL-38 能够限制巨噬细胞的功能，进而打破巨噬细胞维持Th17/Treg 细胞免疫平衡的作用，参与肿瘤、炎症性疾病的发病［24］。免疫微环境的平衡与肿瘤的发生、发展密切相关，其中Th17 细胞和Treg 细胞一直以来是研究肿瘤免疫的热点，Th17 细胞能够促进肿瘤免疫反应，而Treg 细胞能够抑制肿瘤免疫反应［25-27］。既往研究证实，在肾癌患者外周血中Th17 细胞表达增高，Treg 细胞表达降低，且与肾癌患者临床分期和生存预后密切相关［28］。本研究结果与其报道一致，同样发现肾癌患者外周血中Th17 细胞表达增高，Treg 细胞表达降低。基于IL-38 作为Th17/Treg 细胞平衡的重要调控因子，肾癌患者血清中IL-38 异常表达可能是导致肾癌患者免疫失衡进而影响疾病发生、发展的重要因素。

然而，本研究还存在一定的局限性，考虑到本研究为单中心研究，样本量较少，以后还需进行多中心合作，进一步扩大样本量；本研究的随访时间较短，下一步将进一步延长随访时间，观察肾癌患者术后血清中IL-38 水平的动态变化，同时预测其与肾癌患者生存预后的关系；此外本研究为前瞻性队列研究，比较了肾癌患者外周血和癌组织中IL-38 水平，没有进一步深入研究IL-38在肾癌发病中发挥何种作用以及发病机制，未来可以进一步从功能层面深入探讨IL-38 对肾癌细胞作用。

综上所述，本研究发现IL-38 在肾癌患者外周血及组织中均明显降低，血清中IL-38 水平与临床分期及淋巴结转移相关，术后患者血清IL-38 水平高于术前，且其对肾癌具有良好的预测性，有望成为新型生物学标志物。