带血管骨髓移植加速部分清髓受体的造血系统重建

王玉芝 吴燕虹 张斌 唐建兵 程飚 陈建武

南部战区总医院烧伤整形科（广州 510010）

骨髓移植应用广泛，而骨髓微环境对移植骨髓细胞功能的发挥至关重要，它由不同的基质细胞组成，包括内皮细胞、成纤维细胞、脂肪细胞和成骨细胞等。大量研究证实，骨髓细胞联合成骨细胞、间充质干细胞甚至去骨髓的骨瓣等均可促进骨髓植入，有利于清髓受体的造血重建及耐受诱导。同时，基质细胞和骨髓细胞间存在MHC 限制性，即二者MHC相容才有利于骨髓植入［1-2］。而带血管的骨髓移植（vascularized bone marrow transplantation，VBMT）是将含血供的骨组织通过显微血管吻合的方式移植给受体，在不破坏骨髓天然的物理环境的情况下同时移植骨髓细胞和基质细胞，也许可作为一种新的高效骨髓移植方法。本研究目的即利用前期构建的VMBT 模型［3-4］，探索其造血重建潜能。

1 材料与方法

1.1 实验动物近交系Lewis（RT11）大鼠共27只、鼠龄6～8 周，210～230 g、雄性、购自维通利华，动物质量合格证号：SCXK（京）2017-0008。饲养条件为SPF 级，实验动物饲养设施合格证号：SYXK（粤）2019-0100。

1.2 试剂与仪器青霉素钠（哈药集团制药总厂）；戊巴比妥（百瑞金生物）；红细胞裂解液（BioLegend，美国）；1640 培养基和胎牛血清（Hyclone，美国）；小鼠抗大鼠PE-CD90 单抗（eBioscience，美国）；小鼠PE-IgG1 同型对照抗体（BioLegend，美国）；生物学X-ray 辐照仪（Rad Source，美国）；自动细胞计数仪（Inno-Alliance Biotech，美国）。

1.3 实验分组以Lewis 近交系大鼠为动物进行同品系间的骨髓移植，受体移植前1 d 给予5 Gy（1 050 Gy/min）的X 线放射清髓，然后移植骨髓。根据骨髓移植方法的不同分为3 个组，每组6 只：VBMT 组（实验组）移植完整的股骨；i.v.BMT 组（阳性对照组）静脉注射与单根股骨骨髓含量相当的骨髓细胞，约5 × 107/0.5 mL；Control 组（阴性对照组）注射等量生理盐水。

1.4 骨髓移植

1.4.1 带血管的骨髓移植手术步骤同前报道［5］。简单说即切开供体腹股沟区，剥离皮下、暴露股动脉和膝关节；结扎股动脉发出的肌支、腹壁浅和隐动静脉；剥离膝关节周围的肌群；结扎腘动脉的其他分支仅保留分出的膝降动脉；然后分离股动静脉，并保护股深动静脉；最后切断膝关节和髋关节周围的肌肉和韧带，游离出股骨。同样，受体也于腹股沟区做一切口，剥离股动静脉；然后移植供体股骨，股骨头朝内，置于受体腹股沟区，11-0 显微线吻合供受体间的股动静脉，关闭皮肤切口，手术结束（图1）。术后连续3 d 腹腔注射青霉素，10 万U/（kg·d）预防感染。

图1 股骨移植后第10天可见表面肌肉红润、血管蒂搏动良好Fig.1 The transplanted femur was covered by pink muscle tissues with a patent vessel pedicle on postoperative day 10

1.4.2 静脉骨髓移植取大鼠股骨和胫骨，以5 mL含2 %胎牛血清的1640 培养基反复冲洗骨髓腔，收集细胞悬液，200目筛网过滤；350 g离心5 min，去上清后加入2 mL 1×RBC lysis Buffer 裂红3～5 min；再加10 mL PBS 终止裂红，离心后PBS 重悬。然后将所得细胞悬液稀释后，与0.2 %台盼蓝1∶1 等体积混合，自动细胞计数仪进行计数。根据计数结果吸取5 × 107/0.5 mL 的骨髓细胞，经大鼠阴茎背静脉注射骨髓细胞或生理盐水。

1.5 检测指标所有受体于清髓前、清髓后第5、10 和15 天，断尾采血0.3～0.5 mL，血细胞分析仪上监测受体外周血中各种群细胞数的变化。清髓后第10 天处死部分大鼠，剥离脾脏，去除周围的脂肪和筋膜组织后于万分之一电子天平称重，计算脾脏指数。脾脏指数=脾脏质量（mg）/鼠质量（10 g）。脾脏常规行HE 染色切片，而骨组织需甲醛固定后再用10%EDTA 脱钙，每6 h 更换一次脱钙液，直到大头针能轻松刺进骨密质为完成脱钙标准，切片（3～5 μm），HE 染色。清髓后第10 天，分别制备受体股骨和胫骨的骨髓细胞悬液，细胞计数（方法同前）。同时从中吸取100 μL 的单细胞悬液（约106个细胞），加入Anti-Rat CD90 PE 或者IgG2a-PE，室温避光染色15～30 min；流式洗液洗涤2～3 次后500 μL PBS 重悬，流式检测。

1.6 统计学方法所得数据以均数±标准差表示，应用SPSS 20.0统计软件分析行成组t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 外周血各种群细胞的恢复各组大鼠经5 Gy的X 线照射后白细胞和血小板数均显著减少，第5 天时已减少90%以上。之后VBMT 或i.v.BMT 组白细胞逐渐恢复，且恢复速度明显快于对照组，到第15 天时VBMT 组已大致接近照射前水平，i.v.BMT 恢复虽然稍慢于VBMT，但差异无统计学意义。对照组未给予骨髓移植，白细胞恢复迟缓，与i.v.BMT（P=0.003）和VBMT（P＜0.001）相比差异均有统计学意义（P＜0.05，图2A）。同样，VBMT或i.v.BMT 组血小板恢复速度也明显快于对照组（P＜0.05，图2B）。

图2 VBMT 和i.v.BMT 均促进了部分清髓受体白细胞和血小板的恢复Fig.2 Both VBMT and i.v.BMT accelerated recovery of the leukocytes and platelets of nonmyeloablative recipients

2.2 脾集落的生成脾集落是机体受到电离辐射后，造血干细胞迁移到脾脏起代偿性造血的造血灶。它与骨髓中具有增殖分裂能力的造血干细胞数量呈良好的线性关系。在小鼠中脾集落形成较为明显，但本实验中由于放射剂量仅为5 Gy，且大鼠脾脏较大，表面结节不易观察，故对比各组的脾脏指数。放射后10 d可见对照组脾脏明显萎缩，脾脏指数也较低，仅为正常脾脏大小的1/2。i.v.BMT组也发生了轻度的萎缩，且与正常脾指数相比差异有统计学意义（P=0.003），但明显高于对照组（P＜0.001）。而VBMT 组脾脏不但未萎缩，反而有增加趋势，脾脏指数略高于正常脾，但差异无统计学意义（P=0.323，图3）。

图3 脾脏大体观察及脾脏指数变化Fig.3 Gross appearance of the spleens and changes of spleen index after nonmyeloablative irradiation

病理学结果和大体观察类似，正常脾白髓红髓结构清楚，白髓内可见明显的淋巴小结，红髓区脾索内也可见大量淋巴细胞，脾血窦充血富含红细胞。但照射后10 d 对照组发生了明显的损伤性变化，白髓内淋巴小结萎缩甚至消失，其中淋巴细胞数显著减少，红髓内有核细胞也减少。而VBMT 组脾脏组织结构有好转趋势，如白髓内虽然结构较紊乱但淋巴小结增多，周围淋巴细胞也明显增加，脾索内可见大量有核细胞。i.v.BMT 组与VBMT 组表现类似（图4）。

图4 放射后10 d 脾脏HE 染色结果（×40）Fig.4 Hematoxylin and eosin staining results of spleen on 10th day after irradiation（×40）

2.3 造血系统的重建术后10 d 可见移植股骨表面肌肉红润，血管蒂通畅，见图1。骨髓HE 染色与正常骨髓无异可见大量排列紧密的嗜碱性骨髓细胞，边缘清晰，而放射后各组骨髓细胞显著减少，尤其对照组骨髓细胞几乎消失，大部分骨髓被类似脂肪空泡性组织所取代，仅散在的分布少数骨髓细胞。而VBMT 和i.v.BMT 组明显优于对照组，虽然髓腔内也可见大量空泡性组织，但仍有稀疏的骨髓细胞分布（图5）。

图5 放射后10 d 骨髓HE 染色（×40）Fig.5 Hematoxylin and eosin staining results of bone marrow on 10th day after irradiation（×40）

骨髓细胞计数的结果与HE 染色类似，无论股骨还是胫骨，VBMT或i.v.BMT都加速了骨髓的再生或恢复，骨髓细胞数虽少于正常骨髓，但较对照组高一个数量级（P=0.002）。不过VBMT组虽有高于i.v.BMT 的趋势但两者间差异无统计学意义（图6）。进一步比较各组CD90+干细胞数，发现VBMT、i.v.BMT及对照组分别为（21.3±3.5）%，（31.5±1.7）%，（30.1 ± 4.5）%均高于正常组（17.7 ± 2.8）%，且除VBMT 组外差异有统计学意义，提示放射后各组可能均处于活跃造血中。

图6 放射后10 d 各组胫骨和股骨骨髓细胞计数结果Fig.6 Total number of BMCs in tibia and femur on 10th day after irradiation

3 讨论

骨髓中除干细胞外还存在着由毛细血管窦组成的毛细血管网、骨髓内骨架组成的骨小梁网和各种间质（网状）细胞组成的间质细胞网等［6］。而造血细胞即填充于这些网络间隙中，以灶状造血结构的形式存在。周围的各种基质细胞除为造血细胞提供特殊的接触表面外，同时还产生细胞外基质（ECM）成分和造血生长因子，为造血细胞提供生长所需的空间和营养成分，对骨髓功能的正常发挥起着不可或缺的作用［7-8］。本研究在基本不破坏骨髓微环境前提下，同时移植骨髓细胞和微环境，成功加速重建了部分清髓受体的造血系统。这种移植方式有可能作为一种更加高效的骨髓移植方法。因为在其自身的微环境中，不存在MHC 限制性的问题，骨髓细胞可更好的保持自身增殖和分化能力，持续为清髓受体提供基质细胞和造血干细胞。文献报道，静脉骨髓移植联合供体去骨髓的骨瓣皮下或肾包膜下移植可显著增加9 Gy 清髓受体的脾集落数，且可完全防止系统性红斑狼疮小鼠疾病的发生，而单独移植造血干细胞或骨瓣均无效［9-10］。同样，国内研究也发现骨髓细胞联合成骨细胞或间充质干细胞可促进清髓受体的造血或耐受的诱导［11-12］，说明了骨髓基质环境的重要性。这也是门静脉注射全骨髓细胞（含基质细胞）优于传统的静脉骨髓的原因之一，因为门脉注射的骨髓细胞和基质细胞共同阻滞于肝脏内，早期即可在局部相互作用形成了一个造血灶，然后再逐步迁移到全身［13-14］。这一点也与VBMT的造血模式比较相似，首先移植股骨内自我造血，然后再逐步迁移到受体骨髓发挥造血作用。

然而，本研究虽然VBMT 有优于i.v.BMT 的趋势，但差异并无统计学意义，这与以往文献报道的VBMT 优于i.v.BMT 不同［4，15］。分析其原因，可能与实验样本数偏少有关。另外，可能也与本研究所采用的模型和放射剂量相关。因为以往是将大鼠后肢移植给经致死剂量照射的大鼠，而本研究为了排除皮肤、皮下、淋巴等其他组织的影响，采用了一种成分更加单一的模型，即单纯的股骨，从而使两者更加具有可比性。另外，本研究仅给予5 Gy 的剂量照射，使受体体内原有的基质细胞得以存活，为静脉骨髓细胞的生长增殖提供了有利条件［16］，对照组所有大鼠无需骨髓移植即可自我恢复充分说明了这一点。

目前，对于带血管的骨髓移植主要集中异体复合组织移植。因为某些复合组织移植物如手、脸等本身即含有骨瓣，因而研究其中骨髓对于耐受诱导有重要的临床意义［16］。现在已有研究证实，复合组织中的骨瓣在特定的免疫诱导方案下，无需放射清髓和额外的骨髓移植即可自我诱导耐受［4，15］。而灵长类动物实验也发现，在同样的免疫抑制方案下脸移植时如果附带骨瓣则可长期存活，而不带骨瓣则早期排斥，都说明了骨瓣中骨髓的重要作用［17-19］。因此，课题组后续的实验将重点探索带血管的骨髓移植的免疫诱导潜能，从而为其临床应用提供可能的理论基础。