长链非编码RNA LINC00467在卵巢癌的表达及其临床意义

李剑琦 生秀杰

广州医科大学附属第三医院妇科，广东省产科重大疾病重点实验室，广东省普通高校生殖与遗传重点实验室（广州 510150）

长链非编码RNA（LncRNA）是一类由长度大于200个核苷酸组成的RNA分子，其中大多数不翻译成蛋白质，而是以RNA 的形式发挥各种生物学功能［1］。近年来，越来越多的研究［2-5］提示，LncRNA在多种恶性肿瘤中异常表达，并参与调控多种肿瘤发生、发展中的信号通路，从而改变肿瘤细胞的生物学行为，包括细胞分化、增殖、凋亡、自噬、侵袭和迁移等等。大量研究［6-9］表明，LncRNA 在卵巢癌的发生、生长、代谢、侵袭、转移、耐药等多个生物学过程中均发挥着重要作用。本课题组在既往的研究中发现，5-氮杂-2-脱氧胞苷可以逆转MEG3基因的甲基化从而增加LncRNA-MEG3 的表达，LncRNA-MEG3 通过调控P53 和Rb1 起到抑制上皮性卵巢癌细胞的增殖和促进凋亡的作用［10-11］。

LINC00467 是一种最近鉴定出的长链非编码RNA，既往研究［12-19］表明，其在结肠癌、肝癌、肺癌、宫颈癌、胶质瘤、骨肉瘤以及头颈部鳞癌等肿瘤中的表达均会出现失调，从而发挥出不同的肿瘤生物学效应。例如，在结肠癌中，LINC00467的表达量是升高的，通过靶向细胞周期（Cyclin D1、Cyclin A1、CDK2、CDK4 等）以及上皮间质转化（Ecadherin、N-cadherin）相关蛋白，从而发挥出癌基因的作用［14］。近年来越来越多的证据［20］表明，LncRNA可以作为竞争性内源RNA 在多种肿瘤细胞中发挥出癌基因或者抑癌基因的作用。既往研究［21］已经证实，LncRNA中富含微小RNA（micro RNA，miRNA）反应元件（MRE），并且可以充当miRNA 海绵。LncRNA 能够通过海绵化miRNA，将其从下游靶基因mRNA 的结合位点释放，从而调节靶基因的表达。前期的研究中，通过生物信息学分析预测发现LINC00467 中包含miR-302a-3p 的结合位点。

本研究初步探讨卵巢癌LINC00467 的表达情况及其与卵巢癌的临床病理特征的关系，并进一步探究其在卵巢癌细胞的生物学特性及其可能的作用机制，探讨LINC00467 是否可能通过调控miR-302a-3p 而起到抑癌基因的作用，为寻找卵巢癌的早期诊断的标志物奠定基础。

1 材料与方法

1.1 细胞系和卵巢癌组织的获取6 种卵巢癌细胞系（OVCAR-3、SKOV3、A2780、CAOV3、IGROV1和ES-2）和人正常卵巢上皮细胞系（HOSEpiC）购自中国科学院细胞库（中国上海）。所有细胞均使用Dulbecco 改良Eagle 培养基（DMEM）（Corning，Inc.）在37 ℃和5% CO2下培养，该培养基含有10% 胎牛血清（FBS，Corning，Inc.）和1%青霉素-链霉素。广州医科大学第三附属医院2014-2016年共收集了66 例卵巢癌组织（OC，设为卵巢癌组织组）及66 例因良性病变行切除的正常卵巢组织（设为正常组织组），根据卵巢癌组织中LINC00467 的表达情况从高到低排序，前33例设为高表达组（n=33），后33 例设为低表达组（n=33）；上述卵巢癌组织和正常卵巢组织的收集经过患者知情同意后获取，知情同意符合赫尔辛基宣言。本研究经广州医科大学附属第三医院伦理委员会审查批准。

1.2 细胞转染LINC00467 短发夹RNA（shRNA）（sh-LINC00467）、阴性对照shRNA（sh-NC）设计、miR-302a-5p mimics 和miR-302a-5p inhibitor 及其阴性对照（miR-mimics NC、miR-inihibitor NC）设计从广州锐博生物技术有限公司购买。在处理前1 d将4 × 105细胞接种到60 mm 平板中。在操作当天，根据说明书建议的量将20 nmol/L 转染溶液与HiPerFect 和无血清培养基混合，以产生最终体积100 μL 的转染试剂混合物。将混合物溶液孵育15 min 形成转染复合物。将100 μL 的溶液逐滴滴入细胞中，并将混合物置于培养箱中，使用Lipofectamine 3000 试剂（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.）在37 ℃下按照制造商说明将上述试剂转染到细胞中。转染后48 h 收集细胞以备进一步使用。转染基因序列如下：sh-LINC00467#1，5′-CCG GGG TTT AAT AGA CAT GGA TAC TCG AGT ATC CAT GTC TAT TAA ACC TTT TTG-3′ and 5′-AAT TCA AAA ACG GTT TAA TAG ACA TGG ATA CTC GAG TAT CCA TGT CTA TTA AAC C-3′；sh-LINC00467#2，5′-CCG GGA AGA AGA GAA GAG AGA AAC TCG AGT TTC TCT CTT CTC TTC TTC TTT TTG-3′ and 5′-AAT TCA AAA ACG AAG AAG AGA AGA GAG AAA CTC GAG TTT CTC TCT TCT CTT CTT C-3′；sh-NC，5′-CCG GCA ACA AGA TGA AGA GCA CCA ACT CGA GTT GGT GCT CTT CAT CTT GTT GTT TTT G-3′ and 5′-AAT TCA AAA ACC AAC AAG ATG AAG AGC ACC AAC TCG AGT TGG TGC TCT TCA TCT TGT TG-3；miR-302a-5p mimics，5′-UAA GUG CUU CCA UGU UUU GGU GA-3′；miR-mimics NC，5′-CAG UAC UUU UGU GUA GUA CAA-3′；miR-302a-5p inhibitor，5′-AUU CAC GAA GGU ACA AAA CCA CU-3′；miRinihibitor NC，5′-CGA ACG UGU CAC GUT T-3′。

1.3 CCK-8 实验和集落形成实验使用细胞计数试剂盒-8（CCK-8，Dojindo日本）和集落形成试验评估细胞增殖能力。将OVCAR-3 和SKOV3 细胞接种在96 孔板中（每孔2×103个细胞）。将细胞在37 ℃下培养24、48 和72 h，将CCK-8 溶液（10 μL）添加到96孔板的培养基中。然后将混合物在37 ℃孵育1.5 h，并使用分光光度计（BioTek Instruments，Inc，美国）测量450 nm 处的吸光度（OD）。对于集落形成实验，将转染的细胞接种到6 孔板中，并在37 ℃和5%CO2下孵育14 d。随后，细胞集落在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中洗涤3 次，用4%多聚甲醛固定，并在室温下用0.1% 结晶紫（Sigma-Aldrich；Merck KGaA）染色30 min。在显微镜（Leica Microsystems，德国）下计数菌落数。

1.4 Transwell 迁移和侵袭测定对于细胞迁移，细胞转染后，消化细胞，将OVCAR-3 和SKOV3 细胞重新悬浮在不含FBS 的DMEM 中，取细胞悬液100 μL 加入Transwell 小室，将小室架在24 孔板上，在24 孔板下室一般加入600 μL 的培养基。对于细胞侵袭测定，将OVCAR-3 和SKOV3 细胞重悬于不含FBS 的DMEM 中，随后加入覆盖有Matrigel（Corning Inc.）的上室。在这两种测定中，24 孔板的下腔室充满了含有10%FBS 的DMEM。在37 ℃下孵育36 h 后，将Transwell 插入物用PBS 洗涤3 次，用甲醇固定，并在室温下用结晶紫（Sigma-Aldrich，美国）染色30 min。在光学显微镜（Nikon，Tokyo，Japan）下计数侵袭细胞的数量。

1.5 定量实时PCR（qPCR）检测使用Trizol 试剂（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.美国）从冷冻的OC 组织、正常卵巢组织和卵巢癌细胞系中提取总RNA，并使用Revert Aid First-Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo Fisher Scientific，Inc.美国）逆转录为互补DNA。使用SYBR Premix Ex Taq II Kit（TaKaRa，中国）进行qPCR 检测，测定LINC00467和miR-302a-3p 的表达水平。热循环程序包括在94 ℃下保持2 min，然后在94 ℃下30 s、56 ℃下30 s和72 ℃下60 s进行30个循环。在本研究中，GAPDH用作内源性对照。使用2-ΔΔCq方法计算相对mRNA表达。每个样品一式三份进行分析，LINC00467 引物Forward 5′-GCG TAG GCC GGA CAT TTC TA，Reverse 5′-CCT GCC ATG TTG GAA ACT GC；miR-302a-3p 引物Forward 5′- TAA GTG CTT CCA TGT TT，Reverse 5′-TGG TGT CGT GGA GTC G；GAPDH引物Forward 5′-GCA ACT AGG ATG GTG TGG CT，Reverse 5′-TCC CAT TCC CCA GCT CTC ATA。

1.6 双荧光素酶报告基因测定将含有全结合序列的LINC00467 和含有野生型（wt）和突变型（mut）miR-302a-3p 分别克隆到Promega 公司提供的psi-CHECK2 载体中，以生成wt 或mut 质粒，然后，使用Lipofectamine 3000（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.）转染到OVCAR-3 和SKOV3 细胞。在稳定转染36 h 后，根据制造商的说明书步骤进行双荧光素酶报告基因检测（Promega 公司）以检测相对荧光素酶信号。在分析之前，首先将荧光素酶的活性标准化为来自相同细胞的海肾荧光素酶的活性。

1.7 生物信息学分析利用基于癌症基因组图谱（TCGA）的基因表达谱交互分析数据库（GEPIA，http：//gepia.cancer-pku.cn/）评估LINC00467 在OC中的表达水平；通过Starbase 数据库（https：//starbase.sysu.edu.cn）评估LINC00467 与miR-302a-3p 的结合位点。

1.8 统计学方法使用SPSS 17.0软件（SPSS，Inc.）和GraphPad Prism 9.0软件（GraphPad Software，Inc.）进行统计，计量资料使用均值±标准差表示，使用Student′st检验分析；计数资料比较用χ2检验；相关性分析用Pearson 相关性分析；P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LINC00467 在卵巢癌组织（OC）和卵巢癌细胞系中表达上调从GEPIA 下载的表达谱结果提示卵巢癌组织（OC）LINC00467 表达明显高于对照组（图1A）。进一步采用qPCR 检测66 例OC 组织及其66例正常卵巢组织中的LINC00467表达情况，与66 例正常卵巢组织相比，OC 组织中LINC00467的表达明显增高，差异有统计学意义（P＜0.01，图1B）。LINC00467 表达与临床特征（包括组织学类型、病理分级、淋巴结转移和FIGO 分期）的关系见表1，结果显示LINC00467 高表达组和低表达组病理分级、淋巴结转移和FIGO 分期差异有统计学意义（P＜0.05）。卵巢癌患者总生存期的分析结果表明低表达LINC00467 的OC 患者总生存期优于高表达LINC00467 的OC 患者，差异有统计学意义（P＜0.01，图1C）。此外，本研究检测了6 种卵巢癌细胞系（OVCAR-3、SKOV3、A2780、CAOV3、IGROV1和ES-2）和人卵巢上皮细胞系（HOSEpiC）中LINC00467的表达水平，卵巢癌细胞系的LINC00467表达水平显著高于人卵巢上皮细胞系（图1D）。由于在OC 细胞系中OVCAR-3 和SKOV3 两株细胞系LINC00467 表达水平最高，因此将这两株细胞系用于下一步研究。

图1 卵巢癌TCGA 队列中、卵巢癌组织和正常卵巢组织、卵巢癌细胞系和正常卵巢上皮细胞LINC00467A 表达水平Fig.1 LINC00467 is upregulated in OC tissue samples and cell lines，and TCGA

2.2 沉默LINC00467 抑制OVCAR-3 和SKOV3细胞系的增殖、迁移和侵袭能力通过转染sh-LINC00467#1 和sh-LINC00467#2 使OVCAR-3 和SKOV3细胞系中的LINC00467沉默。与sh-NC组对比，sh-LINC00467 转染OVCAR-3 和SKOV3 两种细胞系后LINC00467 的表达均显著下调（图2A）。通过CCK-8检测发现，与sh-NC组对比，sh-LINC00467组OVCAR-3 和SKOV3 细胞的增殖能力逐渐降低（图2B）。再次，sh-LINC00467 转染的OVCAR-3 和SKOV3 细胞中，集落形成试验提示集落数量显著减少（图2C）。同时，Transwell 检测发现，与sh-NC 组比较，sh-LINC00467 组的OVCAR-3 和SKOV3 细胞的迁移和侵袭能力被显著抑制（图2D-E）。

图2 沉默LINC00467 后可显著抑制卵巢癌细胞恶性生物学表型Fig.2 Inhibition of LINC00467 suppresses the abilities of proliferation，migration，and invasion in OC OVCAR-3 and SKOV3 cell lines

2.3 LINC00467 可能通过调控miR-302a-3p 发挥促癌作用进一步通过生物信息学分析预测发现，LINC00467中包含miR-302a-3p的结合位点（图3A）。通过qPCR 检测66 例OC 组织及其66 例正常卵巢组织中的miR-302a-3p 表达情况，发现卵巢癌中miR-302a-3p的表达量明显下降，差异有统计学意义（P＜0.01，图3B），与LINC00467 表达恰好相反，两者呈现出显著的负相关关系（R2=0.381 5，P＜0.01，图3C）。进一步通过荧光素酶报告实验验证了LINC00467 与miR-302a-3p 之间的直接结合关系（图3A）。同时，发现OVCAR-3 和SKOV3 两种卵巢癌细胞系中敲低LINC00467 后，可以显著升高miR-302a-3p 的表达水平，差异有统计学意义（P＜0.01，图3D）。

图3 LINC00467 靶向调控miR-302a-3pFig.3 LINC00467 targets miR-302a-3p in OC cells

3 讨论

卵巢癌是女性肿瘤中第七大常见的肿瘤，仅次于宫颈癌，每年约有152 000 死亡病例，给全球女性的健康造成了严重的威胁［22］。在过去30年中，得益于肿瘤的治疗手段和筛查方法的飞速发展，肿瘤的五年生存率总体上提高了20%，乳腺癌的五年生存率可达85%左右［23］。然而，卵巢癌的诊治水平进步有限，即使在欧美等医疗资源相对丰富的国家，几十年来卵巢癌五年生存率仅仅维持在47%的水平［24］。手术切除是卵巢癌唯一治愈性治疗的手段，其治疗效果依赖于分期和组织学类型［25-26］。据既往研究，早期卵巢癌，即使伴有侵袭性组织亚型，其手术切除治愈率可高达90%［25］。但绝大多数卵巢癌患者在疾病的进展期才被诊断，失去了进行治愈性手术切除的机会，导致卵巢癌的病死率与发病率之比超过0.6；尤其是进展到Ⅲ/Ⅳ期才被诊断的卵巢癌，其病死率甚至超过75%。对于进展期卵巢癌的治疗，目前的治疗仍是基于铂类或紫杉醇的联合治疗［27］。这些治疗方案的使用显著改善了进展期卵巢癌患者的预后。上皮性卵巢癌患者对初始化疗反应非常好，大约80%的患者对此有很好的反应，但是长期的随访结果提示其中许多患者都会复发［26］。因此，深入探究卵巢癌发生发展的分子生物学机制，发现更加有效的早期诊断及精准治疗靶点，对于卵巢癌早筛和治疗都具有十分重要的意义。

目前已经有越来越多的研究表明，LncRNA 在卵巢癌的发生、增殖、代谢、侵袭、转移、耐药等多个生物学过程中均发挥着重要作用［6-9］。LIANG等［6］发现，LncRNA-PTAF 可以调控miR-25/SNAI2信号轴促进卵巢癌发生EMT 和转移。ÖZES 等［28］研究表明，高表达LncRNA HOTAIR 能够提示顺铂耐药的发生，这样的患者接受顺铂后发生死亡的风险比低表达的病人高0.63～2.64 倍，但这种表达的差异对于未接受顺铂治疗患者的死亡风险并无明显影响。

本研究结果提示LINC00467在卵巢癌组织和卵巢癌细胞系中均表达上调，并进一步发现LINC00467高表达与卵巢癌患者的五年生存率等不良预后有明显关系。通过细胞生物学研究进一步发现LINC00467可以促进卵巢癌细胞发生增殖和促进卵巢癌细胞发生侵袭和转移，提示LINC00467 在卵巢癌中可能扮演一个癌基因的角色；揭示LINC00467可作为卵巢癌治疗的一个潜在靶点，因此本研究对其具体调控机制进行了进一步探讨。

目前已知的研究中，比如在原发性肝癌中，LINC00467 的表达量降低，其通过miR-9-5p/PPARA 信号轴发挥抑制肝癌增殖、侵袭、迁移等恶性生物学表型作用［29］。ZHANG 等［19］发现LINC00467可能通过抑制P53 的表达而达到促进脑膜瘤的进展。李思莹等［30］发现LINC00467 可能通过靶向调控miR-495-3p 而抑制视网膜母细胞瘤细胞增殖和凋亡。因此，LncRNA 能够通过海绵化miRNA，将其从下游靶基因mRNA 的结合位点释放，从而调节靶基因的表达。在前期的研究中通过生物信息学分析预测，发现LINC00467 中包含miR-302a-3p 的结合位点。进一步的研究发现LINC00467 与miR-302a-3p 的表达量呈现出负相关关系，也通过通过荧光素酶报告实验验证了LINC00467 与miR-302a-3p 之间的直接结合关系，敲低LINC00467 可以显著升高miR-302a-3p的表达水平，上述结果都验证了笔者的推测，在卵巢癌中高表达的LINC00467可能通过miR-302a-3p 发挥促癌基因的作用。

为了进一步探讨LINC00467 和miR-302a-3p 之间的关系，明确上下游作用，需要在后续的深入研究中使用RNA 结合蛋白免疫沉淀明确LINC00467对miR-302a-3p 的直接调控机制，并探讨下游的可能的mRNA，明确LINC00467 通过哪个信号轴调控卵巢癌的发生发展。