唾液细胞外囊泡miRNA-143/145与雌激素缺乏性骨质疏松相关性的临床研究

沙 莎，陆玲波，郭培培，陈 姝，靳牧涵，徐荣耀,3

骨骼具有机械支持、保护脏器、储存钙磷、造血等功能，这些功能的维持需要骨组织处于骨形成和骨吸收的动态平衡，即需维持骨稳态(bone homeostasis)[1]，中老年女性在绝经后常因雌激素水平骤降导致骨稳态失衡引起骨质疏松[2](即原发Ⅰ型骨质疏松)。绝经期后骨质疏松主要表现为骨密度及骨再生能力降低，危害患者健康[3]；如累及颌骨将直接导致种植牙成功率下降，拔牙创口愈合缓慢，骨折发病率增加等[4]。因此，绝经后骨质疏松早期诊断对提高患者后续生活质量有重要意义。目前，对骨质疏松的诊断主要基于骨密度测定、影像学检查及必要的生化检查等[5]，过程较为繁琐，有待寻找更为简单便捷的诊断方法。

所有细胞均可释放细胞外囊泡，细胞外囊泡是由脂质双分子层构成的杯状结构，内含许多细胞成分，包括DNA、RNA、脂质、代谢物、细胞质和细胞表面蛋白等，存在于多种体液(包括血液、唾液等)中，参与各种细胞间的通信[6]；而微小RNA(microRNA, miRNA)是细胞外囊泡中主要的核酸。miRNA是一类在转录后水平调控基因表达的内源性非编码小RNA[7]，长度为18～25个核苷酸；近年来miRNA因能调控成骨细胞、破骨细胞和骨髓基质细胞(BMSCs)生长分化和衰老而在骨质疏松的预防、诊断和治疗中成为新的靶点[8]；同时，我们在多篇文章中发现miRNA-143和miRNA-145在骨质疏松的进程中发挥重要作用[9-11]，并在公共数据库TAM2.0: A tool for miRNA Set Analysis (http://www.lirmed.com/tam2/)中针对骨质疏松(osteoporosis, postmenopausal)的特征性miRNAs进行分析，结果显示miRNA-145与绝经后骨质疏松相关；在分析其来源上(cell specificity)，间充质干细胞在由于衰老或绝经导致的成脂分化能力增强的过程中，miRNA-145的表达升高，而骨髓组织作为间充质干细胞的主要来源，进一步提示miRNA-145的表达水平可能与骨量的变化有关。因miRNA-143和miRNA-145均位于人类第5号染色体上，两者共用一个启动子和一条pri-miRNA，且被报道发挥类似的功能，故本项目旨在探究唾液细胞外囊泡源miRNA-143/145与雌激素缺乏性骨质疏松的发病是否具有相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

女性的牙槽骨取自2020年1月—2021年6月在南京医科大学附属口腔医院因磨牙至少缺失1年而接受牙植入术的志愿捐赠者，共12例；在牙植入手术中，我们使用φ3.0 mm取骨环钻获取绝经前后女性牙槽骨下颌第一磨牙位置对应的缺牙区来分析松质骨骨密度的差异，以此避免不同牙位的影响。

《中国老年骨质疏松诊疗指南》指出检测骨密度为诊断骨质疏松症的重要指标之一，虽然双能X线骨密度测量(dual X-ray absorptiometry，DXA)是诊断骨质疏松的主要方法，但其具有局限性。首先，DXA只是一种二维(2D)技术，仅量化面积骨密度(bone mineral density, BMD)(g/cm2)，不提供体积(3D) BMD测量(mg/cm3)；其次，DXA不能提供皮质孔隙度等骨三维微结构的信息，也不能区分皮质骨和骨小梁骨密度，在区分如骨质疏松(OP)和表现为骨软化(OM)的代谢性骨病方面有一定局限性[12]；另一方面，肥胖也在一定程度上降低了DXA测量的精度，减肥患者由于体重的减轻容易在DXA图像中引起伪影[13]，这对BMD的结果产生了较大的影响；此外，用DXA测量老年人脊柱和髋关节骨密度时易受到某些退行性病变(如腰椎骨赘或主动脉钙化)的影响，从而误将骨密度提高，低估了这些患者真正的骨折风险[14]；而定量CT作为测量真实体积骨密度的方法，能将皮质骨和松质骨分开评价，不受脊椎增生退变和血管钙化等因素影响，在测量腰椎各椎体间骨密度时准确性明显高于DXA[15]。因此本实验使用锥形束CT机拍摄上述12例患者的颅颌面CBCT影像，获取第三、第四颈椎骨密度以对绝经期前后女性骨密度进行侧面分析。

纳入标准：①无颌骨肿瘤或肿瘤样病变；②未摄入影响骨代谢的药物(糖皮质激素、抗癫痫药物、抗结核药物、含铝抗酸剂、肝素)；③无影响骨代谢和生长发育的系统性疾病(甲状旁腺功能亢进、甲状旁腺功能减退、骨软骨病、肾性骨营养不良、畸形性骨炎、成骨不全、糖尿病)；④无颈椎疾病或外伤史；⑤颅颌面CBCT影像清晰，无明显形态和结构异常，第三、第四颈椎轮廓清晰可辨。

同时收集因骨折、正颌、植牙或阻生牙拔除手术住院患者的血清和唾液(2018年6月—2019年6月)。中国的大部分女性绝经期是在45～55岁，并且为了避免年龄因素造成的干扰，我们选择9例40～45岁女性患者作为绝经前组，10例55～60岁作为绝经后组。对于血样和唾液的收集，早晨在患者未进食状态下采集血液，血样离心取血清样本进行后续检测。同时，在患者清晨未进食且未受刺激的情况下收集唾液样本，使患者取坐位，头稍前倾，舌头的尖端压在上下颚或下颌骨上，轻轻地将唾液吐到采集漏斗中，直到液体的唾液(无气泡)达到近5 mL为止；手持唾液采集管,保持直立，另一只手按压采集漏斗，使漏斗中的唾液流入下方采集管；旋转漏斗,使其从下方采集管脱离，移除漏斗装置后，取出密封盖，旋紧盖子，对采集到的唾液样本进行封存；将采集管反转5次，使唾液和唾液保存溶液充分混合；尽快将收集好的唾液-80 ℃保存备用。

CBCT影像使用和血清、唾液样本采集均由研究对象本人知情同意并签字，本试验经南京医科大学口腔医学院伦理委员会批准(PJ2020-110-001)。

1.2 实验仪器与试剂

micro-CT分析 (Skyscan1176, Bruker, 比利时)；NewTom VG型锥形束CT机(NewTom VG, QR s.r.1,意大利)；ELISA试剂盒(武汉优生尔商贸,中国)；QIAGEN试剂盒(Valencia, CA, 美国)；一体化miRNA qRT-PCR检测试剂盒(GeneCwopole，Rockvill，美国)；透射电子显微镜(TEM，日本电子)。

1.3 试验方法

1.3.1 绝经期前后女性牙槽骨样本micro-CT图像对比 分别取6例绝经前后女性患者牙槽骨样本用于micro-CT分析。在牙植入手术中，我们使用φ3.0 mm取骨环钻获取绝经期前后女性牙槽骨下颌第一磨牙位置对应的缺牙区。将牙槽骨固定于micro-CT(Skyscan1176，Kontich，比利时)样本台进行扫描获得图像，扫描条件：电压为50 kV，电流为456 μA，扫描层厚为18 μm。将扫描所得数据导入NReconv1.6和CTAnv1.13.8.1软件，重建和分析骨骼的三维图像。

1.3.2 检测绝经期前后女性颈椎骨密度 根据中国最新定量CT诊断指南(BMD>120 mg/cm3，正常；80 mg/cm3

1.3.3 检测血清样本中雌激素水平 采用ELISA法检测血清样本中雌激素水平，相关操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.3.4 提取血清和唾液中细胞外囊泡 使用超速离心法提取血清和唾液中的细胞外囊泡。将血清样本移至新的离心管内，2 000×g，4 ℃，30 min离心；取离心获得的上清液，12 000×g，4 ℃，45 min第2次离心；将第2次离心获得的上清液通过0.45 μm滤膜过滤；取过滤液移至新离心管中， 110 000×g，4 ℃，70 min超速离心；弃上层清液，用PBS重悬沉淀，再次110 000×g，4 ℃，70 min超速离心；离心后弃去上清液，所得沉淀即为血清细胞外囊泡，用PBS重悬后，-80 ℃保存。取3 mL收集的唾液于离心管中，加入30 mL生理盐水稀释后，重复上述从血清样本中提取细胞外囊泡的步骤从唾液中提取细胞外囊泡。

1.3.5 观察提取的细胞外囊泡 取先前分离的细胞外囊泡悬液(约10 μL)，当沉淀后去除浮液，常温干燥数分钟，采用透射电子显微镜(TEM)在80 kV下拍摄电镜照片，观察细胞外囊泡形态。

1.3.6 检测血清和唾液样本中miRNA-143/145水平 根据QIAGEN试剂盒说明书提取血清和唾液细胞外囊泡中的miRNA-143/145，再用一体化miRNA qRT-PCR检测试剂盒(GeneCwopole，Rockvill，美国)进行纯化检测。由于在miRNA的检测过程中缺乏稳定并且公认的内参基因，故在miRNA提取时加入ce-miR-39作为外参基因，以标准化miRNA的表达。采用2-ΔΔCT方法进行数据分析，表示miRNA-143/145的表达水平。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0 软件进行统计学分析，结果用均值±标准差表示。试验至少独立重复3次。两组间数据比较采用Studentt检验进行分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 绝经后女性骨密度下降，呈现骨质疏松的趋势

通过micro-CT对比分析绝经期前后女性牙槽骨样本发现，绝经后骨皮质厚度没有明显的变化，但松质骨的骨小梁数目减少、变细变薄，小梁间隙变宽(图1)。通过对松质骨进行骨参数分析结果显示，BV/TV和BMD的值都呈现下降的趋势(图2)。

图1 绝经期前后女性牙槽骨micro-CT影像图Fig.1 Micro-CT images of alveolar bone in premenopausal and postmenopausal women

2.2 雌激素水平下降时，骨密度水平也下降

分析19例绝经前后女性样本中的雌激素水平与骨密度的相关性，发现当雌激素水平下降时，骨密度水平也下降(图3)。

图3 雌激素水平与骨密度水平呈正相关Fig.3 Estrogen levels are positively correlated with BMD levels

2.3 透射电镜下观察血清和唾液中细胞外囊泡形态

通过透射电镜对细胞外囊泡进行形态学观察，可以清晰地看到从血清中提取的细胞外囊泡为双层膜样结构，呈现较均匀的杯状，直径在100～140 nm(图4A)。进一步观察稀释唾液中提取的细胞外囊泡，虽可见唾液中的一些其他杂质，但总体上可以清晰看到细胞外囊泡呈较均匀杯状的双层膜样结构，直径在100～200 nm(图4B)。

*：P<0.05

A：血清中细胞外囊泡(红色三角所指)；B：稀释唾液中细胞外囊泡(红色三角所指)

2.4 血清中的miRNA-143/145水平与雌激素水平呈负相关

检测19例绝经前后女性血清样本中的雌激素水平以及血清细胞外囊泡中的miRNA-143/145水平，发现血清中miRNA-143水平随着雌激素水平的下降而显著上升(图5A);与此同时，miRNA-145水平也随着雌激素水平的下降而显著上升(图5B)，即miRNA-143和miRNA-145水平均与雌激素水平呈负相关。

A：血清中miRNA-143含量与雌激素呈负相关；B：血清中miRNA-145含量与雌激素呈负相关

2.5 唾液miRNA-143/145水平与雌激素水平呈负相关

检测上述唾液样本细胞外囊泡中的miRNA-143/145水平，发现当雌激素缺乏时，miRNA-143水平较高(图6A)，而miRNA-145也处于较高的表达状态(图6B)，说明在唾液样本中miRNA-143/145水平也与雌激素水平呈负相关，与血清样本中细胞外囊泡的检测结果具有良好的一致性。

3 讨 论

雌激素缺乏性骨质疏松是女性在绝经期后由于雌激素水平骤降，破骨细胞增殖分化活跃、凋亡减弱、活性增强，成骨细胞增殖分化减少、活性下降，导致骨稳态失衡、骨内部结构紊乱及骨量丢失引起的骨质疏松[16]；早期因无明显症状易被忽视，但随着病情的进展、骨量的不断丢失，患者易感乏力骨痛，在跌倒摔落等意外情况发生时极易骨折[17]，甚至在后期可出现驼背等脊柱严重畸形的情况。柴波等[18]研究结果表明我国50～59岁绝经后女性骨质疏松症的患病率约为20.38%， 因此， 对雌激素缺乏性骨质疏松的及时诊断显得尤为重要。

A：唾液中miRNA-143含量与雌激素呈负相关；B：唾液中miRNA-145含量与雌激素呈负相关

本试验通过观察绝经期前后女性牙槽骨micro-CT影像学结果，检测骨密度和雌激素水平，对比分析血清和唾液中miRNA-143/145水平与雌激素的相关性，发现女性绝经期后随着雌激素水平的下降，骨密度水平也下降，而血清和唾液中miRNA-143/145水平均随着雌激素水平的下降上升。Weivoda等[8]的研究也证实miRNAs可与多个调控成骨和破骨相关的基因结合，在翻译水平调控基因的表达，从而参与骨骼的发育、稳态和老化等生物过程，提示miRNA-143/145检测对雌激素缺乏性骨质疏松有一定临床诊断价值。但血清或唾液中游离的miRNAs极不稳定，易被RNA酶部分降解，所以在本试验中我们研究细胞外囊泡中的miRNA。

研究表明，细胞外囊泡由多种细胞分泌，并释放到细胞外，以胞吞转运的方式穿过如血脑屏障等上皮屏障，帮助运输一些系统来源的分子成分(包括许多类型的DNA、RNA、蛋白质等)从血液进入唾液。基于其起源以及较小的尺寸，细胞外囊泡参与许多信息传递的过程，包括细胞内通信、程序性细胞死亡、血管生成、免疫反应、细胞和组织稳态、炎症、凝血、细胞迁移、细胞分化等，与细胞生理和病理过程相关[19]。由于细胞外囊泡为脂质双层膜结构，不易被降解且能够保护其内容物免受RNase损伤和其他因素的干扰，所以不仅细胞外囊泡中的miRNA更加稳定、丰度较高[20]，并且细胞外囊泡本身在循环中高度稳定[21]，其内容物和含量的变化多由特定的生理病理条件所引起，因此可以更灵敏地反映受检者的生理病理状态。

人体唾液大部分为水分，还有黏多糖、黏蛋白、唾液淀粉酶、溶菌酶、过氧化物酶等多种有机物以及钠、钾、钙、氯、碳酸氢根等无机物。由于唾液具有与外界、日常饮食直接相通的特点，唾液中的内容物会受细菌、饮食等各种因素的影响，其中游离的分子成分也较容易被降解，对于定性定量而言是一个难题[22]。本试验选择提取唾液中的细胞外囊泡，这样在一定程度上降低了唾液本身内容物的复杂性，又减少了细菌等杂质来源的干扰；同时，又因为细胞外囊泡本身为脂质双层结构，能够保证其内miRNA含量的稳定性，免受RNase损伤和其他因素的干扰。与游离的miRNA检测相比，结果更加稳定可靠，所以唾液细胞外囊泡中miRNA表达更多反映的是受检者的生理病理状态，而非饮食、细菌等因素的影响。此外，本试验发现唾液样本与血清样本中miRNA-143/145的检测结果具有良好的一致性，而相较于采集血样，采集唾液有如下优点：①采样具有无创性，易于重复多次采样；②采样流程较简单，易于操作；③采集的唾液易于处理和储存，张春红等[23]研究发现，当大范围收集样本时，唾液样本更适合在多个实验室和收集点之间传送，更有利于跨实验室间的合作。基于上述优点，提出可通过采集唾液以代替采集血样进行检测，并且可以考虑建立范围更大、覆盖更广的唾液样本库，进一步研究雌激素缺乏性骨质疏松时miRNA-143/145的变化水平，提高通过miRNA-143/145水平诊断雌激素缺乏性骨质疏松的准确性。

唾液检测提供了一种新的、非侵入性的、更为简单的方法来帮助诊断雌激素缺乏性骨质疏松。人体口腔颌面部作为全身矿化组织最多的区域，骨质疏松也会引起颌骨骨量减少、骨密度下降、骨微观结构破坏以及牙槽骨吸收等情况的发生[24]，可能会影响牙齿的牢固性而引发松动，若病情进一步发展，牙齿最终会脱落，导致咀嚼功能的丧失和语音功能的损害。长期牙列缺损将导致牙槽嵴低平，加大了对绝经后女性进行正畸治疗的难度[25]。当颌骨骨密度下降时，还会对口腔微环境造成影响，加快牙周炎致病菌的生长繁殖，引起牙周炎的持续感染；孙鹏飞等[26]研究发现骨质疏松者较正常人更易患牙周炎。此外，在对缺失牙的种植修复过程中，低于正常水平的骨密度可能会影响种植体植入初期的稳定性，造成种植体骨整合质量下降，后期易松动脱落，也有造成种植体边缘性骨吸收的风险[27]。因此，及时诊断雌激素缺乏性骨质疏松并加以治疗，对于牙周病的防治、种植牙成功率的提高、骨皮质切开术的疗效、颌面部手术后骨缺损的再生等方面有较大帮助。

综上所述，本研究结果表明唾液细胞外囊泡中miRNA-143/145水平与雌激素缺乏性骨质疏松有一定联系，通过检测其水平来诊断雌激素缺乏性骨质疏松不失为一种更安全便捷的诊断方式，未来在雌激素缺乏性骨质疏松的诊断中也许有更光明的应用前景。