磁共振弥散张量成像对兔肝缺血再灌注损伤晚期阶段肝损伤程度的评估价值

郭成伟,郝 永，张小燕，金正印，崔现成，王红素，张宝华，吴清华，颜林军

肝缺血再灌注损伤(IRI)是肝脏外科手术需要预防的病理生理过程。目前研究认为肝IRI分为早期(急性期)和晚期(亚急性期)两个阶段[1-2]。多数研究将IRI后2 h或6 h内界定为早期、12～48 h界定为晚期阶段，笔者已经在前期研究证实弥散张量成像(DTI)对兔急性肝IRI具有较好诊断价值[3]，本研究旨在研究磁共振DTI对兔肝IRI后晚期阶段成像参数的变化特点，并与临床常采用评价肝损伤程度的生化指标、炎性因子，以及病理形态学积分行多元相关性分析，以了解平均扩散系数(DCavg)和各向异性系数(FA)对肝IRI的评估价值。

1 材料与方法

1.1肝IRI模型制备及分组 肝IRI模型制作：24只新西兰大白兔[由南方医科大学实验动物中心提供(SCXK2016-0015)]，普通饲养，3～4月龄，体质量2.0～3.0 kg，分为IRI组(18只)与假手术组(6只)。IRI组给予苯巴比妥钠1 ml/kg耳缘静脉麻醉，中上腹部剪毛、清洁、消毒，腹部正中切口8～10 cm，采用3号手术线活结夹闭肝左叶动脉、门静脉，为保证肝IRI成功率、保留肝右叶血供，60 min后，松开手术活结、恢复肝左叶血供，关闭腹腔。依据血供时间分为12 h、24 h与48 h组，每组6只。假手术组打开腹腔、暴露肝门，不阻断肝血供，解剖肝十二指肠韧带。手术过程中，注意保暖，术后置于兔专门饲养室，并适当补液。

1.2MR扫描及参数 设备GE Signa HDxt 3.0T扫描仪，体位：仰卧位，线圈：8通道膝部线圈，静脉麻醉后，用兔实验专用腹带以减轻呼吸运动伪影。MRI-DTI扫描参数：TR/TE 2200/50.3 ms,激励次数(NEX)4次，扫描视野(FOV)20 cm×20 cm，Phase FOV 0.75，矩阵196×128，层厚3 mm。梯度因子b=100、300、600 s/mm2(6个方向)，扫描时间：106 s。

1.3MR图像分析 应用GE AW4.6 FuncTool Performance，对原始图像首先应用Correction进行图像校正，后重建出FA、DCavg图。后设定感兴趣区(ROI)：15 mm2。在不知实验分组的前提下，具有5～10年工作经验的临床影像学诊断医师2名，分别对DTI图像采用双盲法独立阅片、分析、测量、分析数据2次；在肝损伤区域、边缘部分及未发生明显损伤的区域，测量连续三个层面DCavg及FA值，计算均值。

1.4生化、炎性因子水平测定及病理组织学分析 MRI检查结束后，各组实验兔经下腔静脉抽取静脉血5 ml,置于37 ℃水浴箱中2 h，待血液凝固后以60 mm离心半径、3500 r/min的速度4 ℃离心5 min，分离血清。血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)水平采用自动生化分析仪测定；肿瘤坏死因子-α(TNF-α)采用ELISA测定，每组连续测量3次，取平均值。实验结束后、静脉空气栓塞法处死实验兔摘取肝左叶，在10%甲醛溶液中固定，后逐级脱水、石蜡包埋，制成4 μm厚切片，HE染色，光学显微镜下观察肝IRI组织形态学，并参照文献[4-5]进行组织形态学积分。

1.5观察指标 ①磁共振DTI参数：DCavg和FA变化情况；②肝损伤评价指标：ALT、AST、TNF-α水平及病理形态学积分。

2 结果

2.1兔血清AST、ALT、TNF-α水平及形态学积分 各IRI组血清ALT、AST、TNF-α水平及形态学积分均高于假手术组(P<0.05)。IRI 12 h ALT达峰值，IRI 24～48 h逐渐下降；AST在IRI后持续升高，48 h达峰值；TNF-α在IRI后24 h达峰值，后开始下降。IRI 12 h组ALT均高于IRI 24 h和48 h组,AST和形态学积分均低于IRI 24 h和48 h组(P<0.05)；IRI 12 h组TNF-α低于IRI 24 h组，高于IRI 48 h组，且IRI 24 h组高于IRI 48 h组(P<0.05)。见表1。

表1 4组兔血清ALT、AST、TNF-α水平及形态学积分比较

2.2病理组织评分与AST、ALT、TNF-α相关性分析 镜下各组病理形态学积分与AST、ALT及TNF-α均存在高度正相关(r=0.72、0.91、0.80,P<0.01)。

2.3肝IRI各组DCavg、FA变化情况 DCavg在肝IRI 12～24 h均呈下降趋势。b=100 s/mm2时，IRI 24 h组DCavg低于假手术组，IRI 48 h组高于IRI 12、24 h组(P<0.05)；b=300 s/mm2时，IRI 48 h组DCavg高于假手术组及IRI 12 h、24 h组(P<0.05)；b=600 s/mm2，IRI 48 h组DCavg高于假手术组和IRI 24 h组(P<0.05)。随着肝IRI损伤加重，FA在肝缺血再灌注损伤后12～48 h呈逐渐下降趋势。b=300、600 s/mm2时,IRI 24 h组FA低于假手术组(P<0.05),b=100、300、600 s/mm2时，IRI 48 h组FA低于假手术组及IRI 12 h、24 h组(P<0.05)。见表2、图1。

表2 4组不同b值时DCavg及FA值比较

图1 兔肝缺血再灌注损伤24 h组磁共振弥散张量成像(b=300 s/mm2)1a.坏死组织表现为高信号;1b.平均扩散系数较正常组织明显升高(ROI 1～2 vs ROI 3～4)；1c.各向异性系数呈相反的变化趋势；ROI为感兴趣区

2.4MRI-DTI参数与肝损伤指标相关性多元线性回归分析 将DCavg、FA作为因变量，AST、ALT、TNF-α及病理形态学积分作为自变量行多元线性回归分析，标准筛选P为0.05～0.10，将不显著的变量DCavg(b=100、600 s/mm2)排除。DCavg(b=300 s/mm2)、FA(b=100、300、600 s/mm2)与病理形态学积分、AST、ALT、TNF-α存在较好的相关性(P<0.01)。见表3。

表3 病理形态学积分、AST、ALT、TNF-α与DCavg、FA相关性的多元线性回归分析

3 讨论

磁共振DTI是依据组织内水分子的三维弥散特性来探测生物体微观结构的一种功能成像方法，较弥散加权成像(DWI)，其更主要反映出水分子对方向的依赖性，即各向异性弥散[6-7]：生物体内水分子各方向的弥散强度大小不一致，与生物体微结构走行平行方向上弥散最强，而与其方向垂直弥散能力最弱，基于这种生物体内微观组织结构的不同影响水分子自由弥散的方向和速率，FA和DCavg是客观评价参数：FA(0～1)反映水分子运动的方向性，水分子运动的方向越一致，FA值越大；DCavg是所有方向上表面扩散系数(ADC)平均值，较DWI-ADC更加精确描述分子各个方向扩散能力，DCavg值越高表示该处水分子的运动能力越强，否则表示水分子的运动受限[8]。因而DTI成像时间较DWI延长，对磁场不均匀性更为敏感，其有利之处是对肝内微小病灶更易检查，但对DTI图像质量控制带来困难。DTI作为临床一种非创性的早期检测大脑缺血、脑损伤、脑肿瘤鉴别等的敏感方法[9-11]，FA值与神经纤维、髓鞘的完整性、神经纤维的致密性及平行性呈正相关。肝脏内肝窦或纤维结构具有方向性解剖特征，肝细胞外间隙空间大小或纤维结构走行的方向决定肝窦间隙内水分子弥散主轴方向和能力，肝窦或具有方向性纤维结构的解剖特征是肝脏磁共振DTI基础[12]。因此，肝细胞外间隙容积改变、肝胶原纤维排列或数量改变，对应的FA值、DCavg随之发生改变，因此，DTI成像在肝纤维化及肝脏局灶性病变中已广泛应用[13]。肝IRI后肝细胞弥漫性水肿会导致肝窦或细胞外间隙缩小、水分子方向性增高(FA增高)，而水分子运动能力相应下降(DCavg降低)，所以，DCavg、FA可作为临床检测肝IRI病理机制的一种影像评价方法。

有研究发现大鼠肝I/R后60 min，DCavg显著下降、FA上升，而在I/R后24 h DCavg明显上升、FA下降[14]，本研究与其结果存在差异。因此，对于DTI功能成像技术对肝IRI机制及诊断价值等方面的研究还需进一步探索。

本研究结果显示，在IRI后12～48 h，随着微循环障碍的改善、动静脉短路等血流动力学改变，DCavg、FA出现缓慢上升或下降，这与肝IRI早期(急性期1～6 h)因肝窦淤血、肝细胞肿胀等所致水分子在细胞膜内外各个方向上的运动能力下降(DCavg下降)，增加了水分子细胞外间隙运动方向迂曲性致FA上升明显不同[3,15]。在IRI后24 h，DCavg也出现与DWI-ADC类似的一过性下降现象[16]，但与DWI-ADC比较，其下降幅度减小，究其原因可能是 DCavg为各个方向上ADC的平均值，更趋向于稳定，但DTI扫描时间较DWI明显延长，对DTI图像质量控制需要更高的要求[17]。至于IRI 48 h组DCavg显著上升，是由于肝细胞逐渐加重溶解坏死致水分子运动弥散受限减低，但同时也存在着较ADC上升幅度较小的征象，其原因可能是二者成像机制的不同所致[3]。

本研究结果显示，IRI 24、48 h组FA低于假手术组，分析原因，此阶段病理基础是随着肝损伤的加重(镜下组织形态学积分逐渐升高)，肝细胞的正常微观结构丧失，致维持其方向性的细胞网架结构逐渐遭到破坏、溶解，从而使扩散的各向异性减低。因此，FA下降是IRI后肝组织病理过程的体现，这对于评价IRI晚期阶段肝组织损伤、坏死具有重要的意义。

在肝IRI病理过程中，随着肝损伤、坏死的继续加重，AST、ALT变化趋势与镜下组织学评价并不完全一致，本研究结果显示，ALT在肝IRI后12～24 h维持峰值，随后出现下降，与肝IRI继续进展的病情并不一致，肝转氨酶的变化较大，其应用价值也有所受限。而多元线性回归分析可以分析变量间的相对作用大小，达到准确的预后评估和定量诊断目的。本研究结果表明，FA(b=100、300、600 s/mm2)与肝转氨酶、炎性因子、病理学评分存在较好的线性相关，且FA较DCavg具有更高的诊断价值。从b值的选取来看，在b较小时(100 s/mm2)对肝IRI诊断价值较大，这与以往实验结果基本一致[15]。而采用更小的b值(50 s/mm2)可能增加T2投射效应而降低其诊断价值；b值较大(600 s/mm2)时，可能由于肝TE时间较短，使DWI及DTI图像质量降低，影响ADC/DCavg准确性。

综上所述，肝IRI晚期阶段(12～48 h)磁共振DTI能更好、客观反映肝细胞的正常微观结构丧失，细胞网架结构逐渐遭到破坏、溶解等微观病理机制，且该方法具有检查时间短、图像分辨率高及对肝内隐性微小病灶敏感，并能对肝组织的生理状态(肝细胞生理活性和微循环)进行定量和定性评价，符合精准医学的发展要求，肝IRI实验研究可使更多患者受益。