云南道地药材滇黄精中多糖抗2型糖尿病作用研究

张晓灿 段宝忠 陶爱恩 郭文娟 蒙国懿 杨绍坤

1.云南医药健康职业学院，云南 昆明 650033；2.云南省高校滇西道地药材资源开发重点实验室，云南 大理 671000

2型糖尿病是一种多基因遗传性疾病，胰岛素抵抗、脂质代谢紊乱、肥胖、高血压等因素均参与了该病的发生，其中胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)造成的胰岛素相对不足是引发2型糖尿病的关键因素[1]。虽然目前降糖西药能有效的控制高血糖，但对慢性并发症的预防和治疗仍缺乏有效措施，存在不良反应严重、患者依从性差等缺陷[2]。针对糖尿病及其并发症，选择中药降血糖是一个良好的选择。中药降糖呈现多途径、多渠道、多靶点的特点，具有较大的优越性；加之其降血糖作用温和持久，毒副作用小，可有效地延缓并发症的发生和发展[3-7]。因此从中药中寻找降血糖药物已经成为一种趋势。

“药食同源”品种滇黄精PolygonatumkingianumColl. et Hemsl为百合科黄精属多年生草本植物，以根茎入药[8]。滇黄精以“黄精”之名收载于《中国药典》，为云南重要的道地药材，在云南民间具有悠久的药用历史，明代《滇南本草》(1483年)中就记载其用于糖尿病的防治[9]。已有文献研究[10-12]报道滇黄精中的多糖成分是发挥降血糖作用的主要活性成分之一。为全面评价滇黄精多糖的降血糖作用及作用机制，本实验采用高脂高糖饲料联合链脲佐菌素(STZ)诱导实验性糖尿病小鼠评价滇黄精多糖的降血糖作用，并从糖消化吸收、肝脏糖原合成及异生、肌肉组织对糖的利用、胰岛组织形态与功能保护、降血脂、对肾脏的保护等方面，探讨滇黄精多糖的降血糖作用。

1 实验动物、仪器与材料

1.1 材料 滇黄精药材采集于云南大理，经大理大学段宝忠教授鉴定为滇黄精PolygonatumkingianumColl. et Hemsl。

1.2 试剂 实验所用试剂见表1。

表1 实验所用试剂

1.3 仪器 实验所用仪器见表2。

表2 实验所用仪器

1.4 动物 健康清洁级雄性ICR小鼠(18 ～ 22 g)由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，动物合格证号：SCXK(湘)2016-0002。

2 实验方法

2.1 滇黄精总多糖的制备、分离纯化

2.1.1 滇黄精总多糖(PPS)的制备 精确称取干燥的滇黄精药材粗粉适量，按m(药材)：m(95%乙醇)=1∶2进行回流脱脂2 h，过滤得渣，挥干溶剂，备用。将脱脂后的滇黄精粉末按液料比10∶1加入适量水，提取3次，每次提40 min。收集滤液，60 ℃减压浓缩，加入95%的乙醇，搅拌均匀，以乙醇终浓度70%在室温下进行醇沉，24 h后收集沉淀，冷冻干燥得滇黄精总多糖(PPS)。

2.1.2 滇黄精总多糖(PPS)的分离纯化 未冷冻干燥的70%沉淀滇黄精总多糖PPS，直接加入95%的乙醇，使乙醇终浓度为80%，再次沉淀得到PPS1。PPS1用超纯水复溶，上DEAE-琼脂糖凝胶FF柱(4 cm×50 cm)纯化，超纯水洗脱4倍柱体积，洗脱流速为2 mL/min，收集洗脱液浓缩。葡聚糖凝胶G-100凝胶层析柱(4 cm×80 cm)进一步纯化，超纯水洗脱4倍柱体积，收集洗脱液浓缩，冻干即得。

2.2 实验性糖尿病小鼠模型的建立 ICR小鼠购入后先适应性饲养1周。一部分(15只)用基础饲料饲养，另一部分用高脂高糖饲料饲养4周。禁食不禁水12 h，小鼠尾静脉注射链脲佐菌素 120 mg/kg，5 d后测血糖，血糖值>11.1 mmol/L的小鼠选取为糖尿病小鼠，用于后期实验，后期实验中糖尿病小鼠继续用高糖高脂饲料饲养。

2.3 动物分组及给药 取正常未造模小鼠作为正常对照组，将糖尿病小鼠按血糖值随机分成四组：糖尿病小鼠模型组、滇黄精总多糖组(PPS)、滇黄精均一多糖组(PPS1)、二甲双胍阳性对照组，每组15只小鼠。正常对照组及模型组灌胃给予0.9% NaCl，滇黄精总多糖组(PPS)，滇黄精均一多糖组(PPS1)分别灌胃给予1.19 g/kg，阳性组灌胃给予二甲双胍150 mg/kg，1次/d，连续15 d。

2.4 实验评价指标

2.4.1 空腹血糖(FBG)测定 在给药0 d、5 d、10 d、15 d将各给药组小鼠禁食过夜(不禁水)，于次日上午9∶00，用罗氏活力型血糖仪测定血糖值(剪尾取血)。

2.4.2 口服葡萄糖耐量(OTGG)测定 给药 10 d，禁食2 h后，模型组灌胃给予0.9% NaCl，滇黄精总多糖组，滇黄精均一多糖组分别灌胃给予滇黄精多糖1.19 g/kg，阳性组灌胃给予二甲双胍150 mg/kg，给受试药的同时，以4.0 g/kg葡萄糖溶液灌胃，分别在给予药物及葡萄糖后0、30、60、90、120 min时剪尾取血，测血糖值。

2.4.3 血脂水平的检测 采用全自动生化分析仪测定动物血脂水平，主要包括总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)，并计算TC/HDL值。该实验委托大理州医院医学检验科完成。

2.4.4 肝、肌糖原含量测定 取动物肝脏、肌肉适量，按试剂盒说明书步骤进行。

2.5 糖尿病小鼠肾脏、胰腺的病理学研究 实验结束后取小鼠肾脏、胰腺，用福尔马林(10%中性)固定12 h后，送至大理州医院病理科制片(HE染色)。

3 实验结果与分析

3.1 滇黄精总多糖的分离纯化 采用高效凝胶渗透色谱法对PPS1进行分析，结果如图1所示。PPS1的色谱峰为单一对称峰，可得出PPS1是一种均一组分，即一种均一多糖。

3.2 滇黄精多糖对实验性糖尿病小鼠FBG的影响 与正常对照组比较，糖尿病模型组、滇黄精均一多糖组、滇黄精总多糖组、二甲双胍组小鼠的空腹血糖值FBG均显著升高(P<0.001)。连续给药5、10、15 d后，与糖尿病模型组比较，滇黄精总多糖组动物FBG显著下降(P<0.01，P<0.01，P<0.01)，下降幅度分别为下降19.6%，35.6%和36.7%；滇黄精均一多糖组动物FBG亦显著下降(P<0.01，P<0.05，P<0.01)，下降幅度分别为下降37.7%、25.4%和44.4%；二甲双胍组动物FBG也显著下降(P<0.05，P<0.001，P<0.01)，下降幅度分别为下降19.1%、50.7%和40.0%。FBG值见表3。

表3 滇黄精多糖对实验性糖尿病小鼠FBG的影响 (n=15)

综上所述，给药5 d后二甲双胍和滇黄精总多糖、滇黄精均一多糖皆可显著性降低小鼠FBG，且三者之间差异无统计学意义。给药15 d后，滇黄精总多糖、滇黄精均一多糖可使糖尿病小鼠FBG显著降低。

3.3 滇黄精多糖对实验性糖尿病小鼠口服葡萄糖耐量的影响 与正常组比较，各组糖尿病小鼠口服葡萄糖后血糖明显上升(P<0.01)，30 min达到峰值，120 min时血糖水平有所恢复，但仍较给葡萄糖负荷前明显升高。与模型组比较，二甲双胍(P<0.01)、滇黄精总多糖(P<0.05)和滇黄精均一多糖(P<0.01)都可以显著改善糖尿病小鼠葡萄糖耐量，降低餐后2 h血糖值。实验结果如图2所示。

3.4 滇黄精多糖对实验性糖尿病小鼠血脂水平的影响 与正常组比较，糖尿病模型组小鼠血清中的TC(P<0.01)、TG(P<0.01)、TC/HDL(P<0.05)、LDL(P<0.01)水平均显著性升高，HDL水平显著性降低(P<0.01)。与模型组比较，滇黄精总多糖组小鼠血清中的TC(P<0.01)、TG(P<0.01)、TC/HDL(P<0.01)、LDL(P<0.01)水平均显著性降低，HDL水平显著性升高(P<0.05)；滇黄精均一多糖组小鼠血清中的TC(P<0.01)、TG(P<0.05)、LDL(P<0.01)水平均显著性降低，TC/HDL、HDL水平无显著性差异；二甲双胍组小鼠血清中的TC(P<0.05)、TG(P<0.01)、TC/HDL(P<0.01)、LDL(P<0.05)水平均显著性降低，HDL水平显著性升高(P<0.01)。血脂水平测定结果如图3所示。

3.5 滇黄精多糖对实验性糖尿病小鼠肝糖原、肌糖原含量的影响 与正常组比较，糖尿病模型组小鼠的肝糖原、肌糖原含量显著降低(P<0.01)；与模型组比较，二甲双胍组、滇黄精总多糖组均可明显增加肝糖原和肌糖原含量(P<0.01与P<0.05)；滇黄精均一多糖组无显著性差异。实验结果如图4所示。

3.6 滇黄精多糖对实验性糖尿病小鼠肾脏病理改变的影响 实验小鼠肾脏HE染色固定结果如图5所示。糖尿病小鼠肾小球内细胞数目增多，肾小球基底膜增厚。二甲双胍、滇黄精总多糖组和滇黄精均一多糖组能够减少这些病理性损伤的发生。

3.7 滇黄精多糖对实验性糖尿病小鼠胰腺病理改变的影响 胰腺组织样本的HE染色切片如图6所示。正常小鼠的胰腺切片胰岛是圆形的，具有均匀排列的胰岛细胞，边界清晰，且胰岛比其他组更大、更普遍；糖尿病模型组很少显示有胰岛，且胰腺细胞减少、结构松动和变形、凋亡或坏死细胞增多；滇黄精总多糖组、滇黄精均一多糖组、二甲双胍组胰腺病变情况与糖尿病模型组比较均明显改善。与滇黄精总多糖组和二甲双胍组比较，滇黄精均一多糖组的胰岛数量增多、结构完整性较强，胰岛细胞分布更加均匀。结果表明，在链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠治疗中，滇黄精多糖可以减少胰岛破坏。

4 小结

高脂高糖饲料加小剂量链脲佐菌素诱导糖尿病小鼠模型模拟了人类2型糖尿病的发病过程，且主要症状接近于人类2型糖尿病[13-14]。本实验选用该动物模型对滇黄精多糖抗糖尿病活性进行验证，并考察了滇黄精总多糖和滇黄精均一多糖的抗糖尿病活性。实验结果显示，滇黄精总多糖和滇黄精均一多糖均可使糖尿病小鼠的空腹血糖值显著性降低(P<0.01，P<0.01)。给药第5天，滇黄精总多糖组的FBG下降幅度低于滇黄精均一多糖组；给药第10天，滇黄精总多糖组的FBG下降幅度高于滇黄精均一多糖；给药第15天，滇黄精总多糖组的FBG下降幅度又低于滇黄精均一多糖组。滇黄精总多糖组和滇黄精均一多糖组降低FBG的作用效果无显著性差异。

葡萄糖耐量是临床上诊断糖尿病的一个重要依据，高血糖患者通常会出现葡萄糖耐量降低的现象，改善葡萄糖耐量也是评价抗糖尿病药物是否有效的重要指标[15]。本研究发现，滇黄精总多糖和滇黄精均一多糖均能显著改善糖尿病小鼠的葡萄糖耐量，降低餐后血糖值，两者无显著性差异。

糖尿病患者往往伴随血脂代谢紊乱。同时，高血脂症是导致糖尿病心脑血管并发症出现的重要因素[16]。滇黄精总多糖能降低血清总胆固醇和甘油三酯，增加高密度脂蛋白相对含量，降低低密度脂蛋白水平。此外，还能增加糖尿病转归中的肝糖原和肌糖原含量，减少葡糖糖生产，缓解体内糖代谢紊乱现象。滇黄精均一多糖，对高密度脂蛋白的合成无显著影响，但能显著降低血清总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白水平，促进血脂稳态的形成。

糖尿病是以高血糖为特征的可导致各种并发症，危及患者健康的一种内分泌代谢性疾病。糖尿病肾病一般高发于糖尿病后期患者，且会发展为终末期肾脏疾病，是糖尿病致死、致残的主要影响因素[17]。本实验结果显示滇黄精总多糖和滇黄精均一多糖均能缓解糖尿病小鼠肾脏病理性结构变化，减少肾小球糖原沉积和纤维化，具有一定的防治糖尿病肾病的作用。胰岛是位于胰腺外分泌部之间的球状细胞团，糖尿病导致胰岛β细胞凋亡增加，进而导致胰腺组织损伤[18]。本实验结果表明滇黄精总多糖和滇黄精均一多糖可修复糖尿病所引起的胰岛损害，滇黄精均一多糖的作用效果更佳，可使胰岛数量增多、结构完整性增强，胰岛细胞分布更加均匀。

综上所述，滇黄精总多糖和滇黄精均一多糖可改善2型糖尿病小鼠血糖、葡萄糖耐量、血脂水平，并对糖尿病并发症的防治具有一定的作用。