葡萄糖氧化酶和抗菌肽抑制弧菌初步研究

王友娟，张辰仓，徐 祥，夏 伟，张 浩，冷敦鹏

(1.青岛中仁动物药品有限公司，山东 青岛 266329；2.泗阳县水产技术指导站，江苏 宿迁 223700)

目前市场上抑制弧菌的产品主要有抗生素类、消毒剂类、中草药类等。抗生素易导致耐药性和残留隐患，容易破坏水产动物免疫力和正常菌群微生态平衡；消毒剂往往无针对性，存在“通杀”风险；中草药制剂通常见效慢，效果差异较大。因此，开发安全、无抗、高效的新型抗弧菌产品具有重要的现实意义。

研究表明，葡萄糖氧化酶(Glucoseoxidase)能够在氧气存在时催化葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢。葡萄糖酸可以降低胃肠道内酸性，有利于抑制病原菌；过氧化氢具有广谱杀菌的功效，能够抑制多种致病微生物的生长(侯瑾，2016；范一文，2007)。目前葡萄糖氧化酶主要应用于畜禽养殖，在水产上的应用相对较少(尹伦甫，2018；蓝蔚青，2009)。

抗菌肽是一种具有生物活性的小分子多肽，因其显著的杀菌活性和低抗药性成为人们研究的焦点。抗菌肽具有高效广谱的抗菌活性，目前已知对100种细菌有杀灭作用，对某些真菌、原生动物、病毒，尤其对耐药性细菌也有杀灭或抑制作用(简玉瑜，1997；陈善春，1997；陈善春，1996)。国外在抗菌肽对鳗弧菌、杀鲑弧菌及杀鲑气单胞菌等的抑菌作用方面(AtexanderC，1997)做过报道。姜兰等(2002)的研究结果也表明，抗菌肽对水产养殖常见病原菌嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)、梅氏弧菌(Vibrio metschnikovi)、迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)及温和气单胞菌(Aeromonassobria)有较好的抑菌效果。

本文利用葡萄糖氧化酶和抗菌肽，研究这两种物质单独和不同比例复配后的混合物对两种水产致病性弧菌的抑制效果，旨在为无抗内服抑制弧菌产品的研发提供一定参考。现将实验过程及结果报告如下。

一、材料与方法

1.实验材料

(1)实验菌株：溶藻弧菌ZR-NMB-05、副溶血弧菌ZR-NMB-13从南美白对虾体内分离。

(2)试剂：GOD为厂家A生产的葡萄糖氧化酶，酶活含量大于1000单位/克(在规定条件下，每分钟能把1微摩β-D-葡萄糖氧化成D-葡萄糖酸和过氧化氢的酶量为1个酶活力单位，即1单位)；GOD+为厂家A生产的葡萄糖氧化酶＋8%葡萄糖；GOD-为厂家B生产的葡萄糖氧化酶，酶活含量大于1000单位/克；抗菌肽生物效价≥8万单位/克；5%恩诺沙星粉(水产用)由青岛中仁动物药品有限公司生产。胰酪胨大豆肉汤培养基(TSB)、胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)购自青岛海博生物技术有限公司，110毫米直径定性滤纸购自杭州新华纸业有限公司。

(3)主要设备：震荡培养箱(HZQ-F160)、恒温培养箱(DHP-9052)。

2.实验方法

葡萄糖氧化酶、抗菌肽和恩诺沙星粉抑制弧菌效果验证。

(1)菌种活化：将溶藻弧菌ZR-NMB-05和副溶血弧菌ZR-NMB-13从-80℃冰箱中取出，37℃水浴快速融化后，分别接种到TSB液体培养基(含2.5%氯化钠)中，28℃、120转/分过夜培养，然后用接种环蘸取菌液在TSA平板(含2.5%氯化钠)上划线，置于28℃恒温培养箱中过夜培养。

(2)药敏纸片制作：使用打孔器和滤纸片制作圆形药敏纸片。分别称取GOD、GOD+、GOD-、抗菌肽以及5%恩诺沙星粉各2克放于20毫升无菌蒸馏水中充分溶解，将药敏纸片放于药液中浸泡30分钟，然后将药敏纸片捞出控一下残液，摊开于洁净无菌的玻璃培养皿上自然晾干，之后收集、标记。

(3)菌悬液制作：参照麦氏比浊管，分别挑取两株弧菌的单菌落，使用灭菌生理盐水稀释，将溶藻弧菌和副溶血弧菌的浑浊度调至1号管(细菌的浓度约为3×108个/毫升)，然后稀释10倍。

(4)菌悬液涂布：分别吸取两株弧菌的菌悬液100微升于TSA固体培养基上，使用无菌涂布棒将菌悬液涂布均匀。

(5)贴药敏纸片：将药敏纸片贴到涂有菌悬液的固体培养基上。

(6)培养：将培养基倒置放于恒温培养箱中，28℃过夜培养。

通过恩诺沙星的对照作用，选出对溶藻弧菌和副溶血弧菌均有显著抑制作用的GOD和有抑制作用抗菌肽，用GOD和抗菌肽不同质量比(1∶1、1∶3、1∶5、1∶7)的混合物制作药敏纸片。其余操作步骤同上，进行复合物抑菌效果验证。

二、结果

1.葡萄糖氧化酶、抗菌肽和5%恩诺沙星粉抑制弧菌效果验证

GOD、GOD+、GOD-、抗菌肽和5%恩诺沙星粉对溶藻弧菌ZR-NMB-05的抑制效果见图1。由图1可知，溶藻弧菌ZR-NMB-05对GOD、GOD+、5%恩诺沙星高度敏感，对GOD-不敏感，GOD对溶藻弧菌的抑制效果略优于5%恩诺沙星粉。抗菌肽对溶藻弧菌抑制作用弱于前三者。

图1 几种试剂对溶藻弧菌的抑制效果

GOD、GOD+、GOD-、抗菌肽和5%恩诺沙星粉对副溶血弧菌ZR-NMB-13的抑制效果见图2。由图2可知，副溶血弧菌ZR-NMB-13对GOD、GOD+、5%恩诺沙星粉高度敏感，对GOD-中度敏感，抗菌肽对副溶血弧菌抑制作用相对较弱。

图2 几种试剂对副溶血弧菌的抑制效果

2.GOD、抗菌肽不同配比混合物抑制弧菌效果验证

GOD、抗菌肽以及GOD和抗菌肽不同质量比(1∶1、1∶3、1∶5、1∶7)的混合物对溶藻弧菌ZR-NMB-05和副溶血弧菌ZR-NMB-13的抑制效果见图3、图4。从图3、图4可以看出，不同配比的GOD和抗菌肽混合物对于溶藻弧菌和副溶血弧菌的抑制效果差别不大，两者复配显示出协同增效作用。

图3 不同配比混合物对溶藻弧菌的抑制效果

图4 不同配比混合物对副溶血弧菌的抑制效果

三、讨论

本文实验证实，葡萄糖氧化酶和抗菌肽对分离的两株弧菌均具有一定的抑制作用，可以作为内服抑弧菌产品开发原料的储备。因菌悬液的制作采用麦氏比浊法，虽然浑浊度均调至1号管，但因目测具有一定主观性和随机性，易造成结果误差，从本实验平板涂布的菌苔厚度和密度也能看出差异，因此最好采用麦氏比浊仪来统一菌悬液浓度，使抑菌结果更具有参考性。实验中也发现，虽然GOD和抗菌肽不同配比的混合物对于两种弧菌的抑制效果没有明显差异，但两者复配对副溶血弧菌的抑制效果具有协同增效作用，具体作用机理还有待进一步研究。

作为一种特殊的功能性添加剂，葡萄糖氧化酶作用的发挥依赖于葡萄糖的存在，葡萄糖添加量的多少直接影响葡萄糖氧化酶抑菌功能的发挥。尤其在体外实验中，葡萄糖的多少对于实验的成败至关重要(荆新堂，2020)。由于发酵生产葡萄糖氧化酶时对其进行分离和纯化的工艺比较复杂，导致葡萄糖氧化酶的生产成本居高不下，从而制约了葡萄糖氧化酶在我国饲料工业中规模化应用(肖志明，2014)。如何更经济有效地制备和提纯葡萄糖氧化酶是今后研究的方向。