MicroRNA-212 通过调控TGF-β1/Smads 信号通路对积水肾纤维化进展的影响

曹智修 袁敬东 章传华 柳懿鹏 黄 韬 朱金燕 孙 莹 杨 娟

武汉市第一医院泌尿外科 湖北 武汉 430022

慢性肾病（chronic kidney disease，CKD）是各种原因引起的慢性肾脏结构和功能障碍，是终末期肾衰竭的进展过程，肾纤维化几乎发生于CKD 的每个阶段，同时肾纤维化是影响CKD 患者发病率和死亡率 最 重 要 的 因 素［1，2］。microRNA 是 小 分 子 内 源 性非蛋白编码短RNA，它通过调节靶基因来调控细胞程序，如细胞代谢、增殖、分化、死亡及多种疾病的病理生理。microRNA 在肾脏疾病发生、发展中亦起着非常重要的的作用［3，4］，研究证实microRNA 通过 促 进TGF-β 的 表 达 从 而 促 进 纤 维 化 的 发 展［5］。在输尿管梗阻模型中发现microRNA-212 与肾间质纤维化关系密切，其能促进肾间质纤维因子的表达［6］，但具体机制尚未阐明。本研究旨在分析microRNA-212 对积水肾纤维化的的影响，为肾纤维化的诊断及治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组24 只雄性C57BL/6J 小鼠，8 周大小，体重（25±3）g，购自华中科技大学同济医学院动物实验中心，随机分为Sham 组（假手术组），a 组（单侧输尿管梗阻组）、b 组（假手术+microRNA-212 血清静脉注射组）、c 组（假手术+生理盐水静脉注射组）。 饲养坏境湿度50%～70%，温度（23.2±2.0）℃，自由饮水，标准小鼠饲料喂养，日光灯照明，每12 h 光暗交替。所有动物处理均获得武汉市第一医院伦理委员会批准。

1.2 主要试剂和材料Exo/miroRNA-212 提取试剂盒购自Cell Signaling Technology 公司（美国，波士顿），RNA 提取试剂盒购自Invitrogen 公司（美国，卡尔斯巴德），PCR 试剂盒购自Cell Signaling Technology 公司（美国，波士顿），α 平滑肌肌动蛋白（α-SMA）抗体购自R&D 公司（美国，明尼阿波里斯），TGF-β1 和p-Smad3 蛋白抗体购自Santa 公司（美国，圣克鲁斯），荧光二抗购自LI-CRO Biosciences 公司（美国，内布拉斯加）。

1.3 动物处理动物分组后，Sham 组小鼠以1%的戊巴比妥钠50 mg/kg 腹腔注射麻醉后，左侧腹部切口，暴露并分离左侧输尿管后缝合切口，1 周后提取血清组织并检测microRNA-212 含量；a 组小鼠麻醉后后，切开并暴露左侧输尿管，取直径2 mm 聚乙烯塑料导管2 cm，纵行剖开，套扎于左侧输尿管上段1/3 处，缝合切口，7 d 后处死并提取血清和肾脏组织；b 组小鼠行Sham 组相同假手术处理后，持续1周按照80%的浓度尾静脉注射由a 组小鼠提取的microRNA-212 血清提取物（20 mL/kg）；c 组小鼠行Sham 组相同假手术处理后，持续1 周尾静脉注射生理盐水（20 mL/kg）。

1.4 microRNA-212 提取和检测按照试剂盒操作说明提取Sham 组和a 组小鼠血清中microRNA-212，并按照试剂盒操作说明通过RT-PCR 检测Sham 组和a 组小鼠血清中microRNA-212 含量。

1.5 组织的提取和Masson 染色各组小鼠干预完成后采用断椎法处死，提取肾脏组织，剥离肾包膜，肾脏组织分成两份，一份保存于10%甲醛溶液中，随后行石蜡包埋、切片，一份于-80 ℃低温保存，取石蜡切片行Masson 染色，随机选取5 个视野进行观察并按照Cao 等［7］介绍的方法计算每个视野的纤维化比例（fibrosis ratio，FR）。

1.6 α-SMA 免疫组化染色石蜡切片经脱蜡、脱水、抗原修复后，加兔抗鼠α-SMA 一抗于4 ℃过夜，冲洗干净后加入羊抗兔二抗（碧云天生物技术研究所，批号：20211142）并行着色、脱水、封片，于Olympus70 显微镜下观察。随机选取5 个视野进行观察并按照Cao 等［7］介绍的方法计算每个视野的α-SMA表达评分。

1.7 Western Blot 测TGF-β1 和Smad3 蛋白表达取小鼠肾脏组织切碎后加单去污剂裂解液裂，置于自动匀浆机中匀浆置于冰上30 min 充分裂解，4 ℃离心后吸取上清液用BCA 试剂盒法测定蛋白浓度，分装后用-80 ℃冻存，备用。蛋白样品中加入上样缓冲液，煮沸变性，冷却后加入SDS-PAGE上行凝胶电泳。依次转膜、漂洗、封闭，分别加入TGF-β1 和p-Smad3 蛋白一抗4 ℃孵育过夜，漂洗后荧光二抗孵育后，于奥德赛蛋白膜扫描仪上扫描。

1.8 数据统计与分析本实验计量数据均以±s表示，统计学分析使用SPSS 21.0 软件处理。多组间比较采用One-way ANOVA 进行分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肾实质纤维化评估a、b 两组小鼠纤维化明显（图1），a、b 两组Masson 染色肾脏FR 较Sham 组和c 组明显增加（P＜0.05），a、b 两组FR 无明显差别，Sham 组和c 组FR 无明显差别（P＞0.05）。

图1 各组小鼠肾组织纤维化情况

2.2 Micro-RNA212 含量的表达Sham 组和a 组microRNA - 212 表 达 分 别 为0.020±0.004 和1.530±0.006，二者相比有显著差异（P＜0.01）。

2.3 纤维化相关蛋白α-SMA 的表达a 组和b 组小鼠α-SMA 蛋白表达评分与Sham 组和c 组相比明显增加（P＜0.05），a 组和b 组α-SMA 蛋白表达百分比无明显差别，Sham 组和c 组α-SMA 蛋白表达百分比无明显差别（P＞0.05）（图2）。

图2 各组小鼠肾组织α-SMA 表达情况

2.4 TGF-β1 和p-Smad3 蛋白表达a 组和b 组小鼠TGF-β 和p-Smad3 蛋白表达评分与Sham 组和c组相比明显增加（P＜0.05），a 组和b 组鼠TGF-β1和p-Smad3 蛋白表达评分无明显差别，Sham 组和c组鼠TGF-β 和p-Smad3 蛋白表达评分无明显差别（P＞0.05）（图3）。

图3 各组TGF-β1、p-Smad3 蛋白表达

3 讨论

研究发现microRNA 的表达与炎性疾病、代谢性疾病及肿瘤等众多疾病密切相关［8，9］，其在肾肿瘤、糖尿病肾病和急慢性肾损伤等肾脏疾病中亦发挥着重要作用［1，10］。同时，研究证实较多microRNA与肾纤维化发生与发展密切相关，microRNA 可通过靶向作用于TGF-β 进而促进纤维化的发展，亦可通过抑制上皮-间质转化而调控纤维化发展进程［11，12］，但microRNA-212 对肾纤维化的影响目前报道尚少。本研究发现将a 组输尿管梗阻小鼠血清外泌体中提取的microRNA-212 注射到假手术组b组后，天狼星红染色即可发现b 组出现明显纤维化，说明microRNA-212 可促进纤维化的发生与发展。

肾纤维化是导致慢性肾病肾功能减退和形成终末期肾病的主要因素，α-SMA 是肌成纤维的标志性蛋白，通常仅在血管壁中层表达，而在病理情况下，肾小管间质细胞、肾小球系膜细胞、壁层上皮细胞、内皮细胞和肾小管间质细胞瘤可转化为肌成纤维细胞而高表达α-SMA。α-SMA 是上皮间充质转变的标志蛋白，因此，其表达增加是肾纤维化进展的标志［13］。本研究发现输尿管梗阻的a 组小鼠和注射a 组小鼠外泌体中提取的microRNA-212 的b 组小鼠α-SMA 均明显升高，进一步证实microRNA-212 可促进纤维化的发生与发展。

TGF-β1/Smads 信号通路在肾纤维化中起着至关重要的作用，是肾纤维化最主要和最经典的信号通路之一，其激活可直接诱导ECM 的沉积，也可以通过促进上皮间质转化而增加ECM 的产生［14］。Smad3 是TGF-β1/Smads 信号通路的重要信号传递因子，通过与其他Smad 蛋白形成多聚体转移到细胞核内调控靶基因的转录从而促进纤维化的发生与发展［15］。本研究亦证实纤维化严重的a 组和b 组小鼠TGF-β1 蛋白和Smad3 蛋白表达明显升高，说明microRNA-212 是通过促进TGF-β1/Smads 信号通路的激活而诱导小鼠肾纤维化的发生与发展的。

综上所述，输尿管梗阻肾脏通过外泌体转运的microRNA-212 可激活TGF-β1/Smad3 信号通路，从而促进肾纤维化的发生发展。但microRNA-212是否为主要激活TGF-β1/Smad3 信号通路的因素还需进一步证实。