过氧化氢-乙酸联合预处理对甘蔗渣酶解和发酵的影响

孟繁阳， 李 宁， 史正军,2， 杨海艳,2， 赵 平,2, 杨 静,2*

(1.西南林业大学 化学工程学院，云南 昆明 650224； 2.云南省高校特色林木生物质资源化学利用重点实验室；西南林业大学,云南 昆明 650224)

生物质作为一种绿色、可再生的资源，蕴含着丰富的生物质能，经过热解、化学和物理法等处理方式可以将其转变为高附加值的绿色能源和生物基材料[1]，是石油资源的优良替代品。甘蔗属于禾本科植物，我国甘蔗产量丰富，年产量约为7 000万吨，榨汁后的甘蔗渣属于农林废弃物，直接燃烧或丢弃不仅污染环境，也会造成资源的浪费，其中的生物质能如何合理、高效地利用对于改善我国能源结构具有很高的研究价值[2]。木质纤维生物质主要由纤维素、半纤维素、木质素以及少量的果胶组成，其主要成分之间相互交联形成了致密的天然抗降解屏障，这些屏障阻碍了纤维素酶对碳水化合物的可及性，使生物质难以被化学或生物利用。生物质经过物理法、化学法、物理化学法和生物法等预处理可以减轻或消除这些屏障的影响，增加酶对碳水化合物的可及性，提高生物质的化学或生物的利用效率[3-5]。本研究采用过氧化氢和乙酸(H2O2-HAc)在浓硫酸催化作用下产生过氧乙酸，并对甘蔗渣进行过氧化氢-乙酸联合预处理(HPAC)，分别考察温度和过氧化氢浓度对甘蔗渣酶水解效率和乙醇发酵得率的影响，以及甘蔗渣表面结构特征的变化，探索农林废弃物预处理及高效酶解的工艺和模式，为生物质炼制燃料乙醇和糖基化合物的研究提供可借鉴的思路和理论依据。

1 实 验

1.1 材料和试剂

甘蔗渣(SCB)由云南省德宏州英茂糖业有限公司提供，粉碎至0.250～0.380 mm，备用。纤维素酶(Cellic CTec2)由上海Sigma-Aldrich提供，滤纸酶活为250 FPU/mL。酵母，购自宜昌安琪酵母股份有限公司。

过氧化氢(质量分数30%)，乙酸(质量分数99%)，浓硫酸(质量分数98%)，均为市售分析纯。柠檬酸缓冲溶液(pH值为4.45)，稀释20倍pH值为4.8。葡萄糖，购自国药集团化学试剂有限公司；考马斯亮蓝，购自广州市赛国生物科技有限责任公司；孟加拉玫瑰红，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；直接红，购自成都市科隆化学品有限公司；酵母提取物，购自北京奥博星生物技术有限责任公司。

TU-1901紫外分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；Thermo SCIENTIFIC K-Alpha能谱仪，美国Thermo Fisher Scientific公司；Zeiss Sigma 300发射电子显微镜，德国Carl-Zeiss-Stiftung公司；Agilent 1260高效液相色谱仪，美国Agilent公司。

1.2 甘蔗渣的预处理

1.2.1过氧化氢预处理 20 g甘蔗渣与300 mL的过氧化氢(30%)充分混合，在70 ℃反应2 h，待冷却后，用蒸馏水冲洗至中性，40 ℃烘箱烘干，备用，命名为HP/70-SCB。

1.2.2乙酸预处理 20 g甘蔗渣与300 mL的乙酸(99%)充分混合，在70 ℃反应2 h，待冷却后，用蒸馏水冲洗至中性，40 ℃烘箱烘干，备用，命名为AC/70-SCB。

1.2.3过氧化氢-乙酸联合预处理 将同等体积的过氧化氢和乙酸混合，加入0.5%(体积分数，以过氧化氢和乙酸的总体积计)的浓硫酸作为催化剂。20 g甘蔗渣与300 mL的上述混合液充分混合，在30、 50、 70 ℃反应2 h，按照温度的不同分别命名为HPAC/30-SCB、HPAC/50-SCB、HPAC/70-SCB。将过氧化氢的浓度降低为原来的1/2，与同等体积的乙酸混合，再加入0.5%的浓硫酸(同上)，在70 ℃反应2 h，待冷却后，用蒸馏水冲洗至中性，40 ℃烘箱烘干，备用，命名为HPAC/70-SCB- 0.5。

1.3 预处理甘蔗渣的酶水解和发酵

1.3.1预处理甘蔗渣的酶水解 取适量底物(预处理后的甘蔗渣，质量浓度0.05 g/mL)，和纤维素酶5 FPIU/g(基于底物)加入50 mL的锥形瓶中，加入适量的柠檬酸缓冲溶液使反应体系(20 mL)的pH值为4.8，在50 ℃、 150 r/min反应72 h，酶水解过程中定时取样用以测定酶解过程中的还原糖浓度以及上清液中的酶蛋白质含量[6]。待反应结束后，固液分离，酶水解上清液放置于4 ℃冰箱，用于发酵产乙醇。

1.3.2甘蔗渣水解液的发酵 将葡萄糖(0.05 g/mL)和酵母提取物(0.1 g/mL)混合，加入0.216 g酵母，制备成8 mL的酵母溶液，35 ℃活化30 min。取酶水解上清液4 mL与0.5 mL的酵母溶液混合，并放置于35 ℃培养箱中发酵24 h[7]。

1.4 分析与表征

1.4.1甘蔗渣化学成分测定 原料及预处理甘蔗渣的主要成分测定方法参考GB/T 36058—2018[8]。

1.4.2酶解上清液蛋白质浓度测定 采用Bradford法测定酶解上清液中的纤维素酶蛋白质浓度[9]。取2 mL考马斯亮蓝溶液与0.1 mL水解上清液混合，5 min后反应达到稳定，用紫外分光光度计在595 nm处测定吸光值，制作蛋白质与吸光值的标准曲线，根据吸光值确定蛋白质浓度。

1.4.3疏水度测定 按文献[10]用玫瑰红法测定甘蔗渣的疏水度。具体操作如下：分别取不同质量(0、 0.04、 0.08、 0.12、 0.16、 0.20 g)预处理的甘蔗渣与5 mL玫瑰红染液混合，在50 ℃、 150 r/min反应2 h，离心，取上清液于543 nm处测定吸光值，确定吸附的染液质量和分割熵(PQ，吸附染料与残余染料之比)。以物料在染液中的浓度为横坐标，PQ值为纵坐标，进行线性拟合，所得斜率即为底物的疏水度。

1.4.4酶可及度测定 采用直接红法测定甘蔗渣的酶可及度[11]。操作如下：取0.2 g预处理的甘蔗渣与20 mL不同质量浓度(0、 0.05、 0.1、 0.5、 1.0、 2.0、 3.0、 4.0 g/L)的直接红染液混合，在50 ℃、 150 r/min反应24 h。离心后取上清液于498 nm处测定染液吸光值，计算吸附的染料质量，使用Langmuir等温吸附曲线进行非线性拟合，确定底物的酶可及度。

1.4.5XPS分析 采用Thermo SCIENTIFIC K-Alpha能谱仪，X射线能量1 486.8 eV，测试电压15 kV，在真空2×10-7Pa下测定样品的X射线能谱。木质素和碳水化合物的表面覆盖率(S)根据氧碳比(氧原子与碳原子的个数比)求得，其计算公式如下：

SL=(O/C0-O/CC)/(O/CL-O/CC)

(1)

SC=1-SL

(2)

式中：SL—木质素的表面覆盖率,%；SC—碳水化合物的表面覆盖率,%；O/C0—底物的氧碳比；O/CL—木质素的氧碳比，0.33；O/CC—碳水化合物的氧碳比，0.83。

1.4.6扫描电镜分析 采用Zeiss Sigma 300发射电子显微镜观察分析样品的表面特征，喷金处理，加速电压为10.00 kV，探测器为InLens，工作距离为7.0 mm，放大倍数为5 000倍。

1.4.7水解液中还原糖和乙醇的测定 酶水解上清液和发酵液通过高效液相色谱仪(Agilent 1260)测定其中的还原糖含量和乙醇浓度，分析柱为Aminex HPX-87H(300 mm×7.8 mm，9 μm)，流动相是0.005 mol/L的硫酸，流速为0.6 mL/min，柱温是55 ℃，在示差折光检测器(RI)上进行检测。葡萄糖、木糖和乙醇得率的计算公式如下[12]：

Y1=(C1×0.9×0.02)/(m×ω1)×100%

(3)

Y2=(C2×0.88×0.02)/(m×ω2)×100%

(4)

Y3=C3/(C4×0.51)×100%

(5)

式中：Y1—葡萄糖的得率，%；C1—水解液中葡萄糖质量浓度，g/L； 0.9—纤维素和葡萄糖的转化系数； 0.02—水解液的体积，L；m—底物的质量，g；ω1—底物中纤维素的质量分数，%；Y2—木糖得率，%；C2—水解液中木糖质量浓度，g/L； 0.88—半纤维素和木糖的转化系数；ω2—底物中半纤维素的质量分数，%；Y3—乙醇得率，%；C3—发酵液中乙醇的质量浓度，g/L；C4—发酵液中葡萄糖的初始质量浓度，g/L； 0.51—葡萄糖转化为乙醇的理论系数。

2 结果与讨论

2.1 过氧化氢-乙酸联合预处理对甘蔗渣化学组分和表面结构特征的影响

2.1.1化学成分 预处理后的甘蔗渣化学组分变化如表1所示。原料甘蔗渣中含纤维素(以葡聚糖表示)、半纤维素(以木聚糖表示)和木质素分别为49.02%、 22.78%和24.38%。过氧化氢(HP)单独预处理和乙酸(AC)单独预处理对甘蔗渣的纤维素和半纤维素没有明显影响，降低了木质素的质量分数，木质素从原料的24.38%降低至23.57%(HP预处理)和20.65%(AC预处理)，降低了3.3%～15%。然而，经过氧化氢-乙酸联合预处理后，尽管半纤维素含量没有明显的变化，但木质素含量明显减少。当预处理温度从30 ℃升高到70 ℃时，HPAC/30-SCB、HPAC/50-SCB和HPAC/70-SCB含木质素分别为17.58%、 9.76%和2.58%，与原料(24.38%)相比降低了27.89%、 59.96%和89.42%，尤其是HPAC/70-SCB，其木质素脱除率达到95.30%，同时91.40%的纤维素被保留在预处理底物中，将有利于后续的酶解糖化过程。

表1 HPAC预处理前后甘蔗渣各组分变化及木质素脱除率

此外，当过氧化氢的浓度降低至原来的1/2，即过氧化氢质量分数为15%时，配制成过氧化氢-乙酸溶液，在70 ℃预处理条件下，甘蔗渣中90.10%的纤维素被保留，HPAC/70-SCB- 0.5含纤维素为62.74%，木质素脱除率为88.85%。与相同预处理条件下30%过氧化氢预处理相比较，木质素的脱除率减少了6.77%，这主要是因为过氧化氢浓度的降低导致过氧乙酸的浓度降低，预处理程度减缓。过氧化氢与乙酸在浓硫酸的催化下生成过氧乙酸，在酸性介质中产生的亲电的OH+对木质素上的烯烃基、羰基、芳香环结构具有较高的反应活性，从而导致了木质素的降解，而纤维素中的醇羟基对OH+的反应活性较低，因而仅有少量纤维素被脱除[13]。

2.1.2表面特征 用XPS分析甘蔗渣预处理前后表面化学特征的变化情况，结果见表2。从表2中可以看出，原料甘蔗渣(SCB)的氧碳比和木质素表面覆盖率分别为0.50和66%，说明原料表面存在大量的木质素[14]；经单独过氧化氢预处理后的甘蔗渣(HP/70-SCB)的氧碳比提高至0.67，木质素表面覆盖率降低至32%，说明表面的木质素被部分脱除；经单独乙酸预处理的甘蔗渣(AC/70-SCB)的氧碳比和木质素覆盖率没有明显变化；而经过氧化氢-乙酸联合预处理后的甘蔗渣(HPAC/70-SCB- 0.5)的氧碳比增加至0.72，木质素表面覆盖率降低至22%，木质素表面覆盖率与单独过氧化氢和单独乙酸预处理相比分别降低了31.25%和66.67%，说明HPAC/70-SCB- 0.5表面大量木质素被脱除，并暴露出更多的碳水化合物，因此具有较高的酶可及度和较低的疏水度[15]。

表2 HPAC预处理前后甘蔗渣的氧碳比、表面覆盖率及C1s谱图

2.1.3SEM分析 图1为甘蔗渣预处理前后的表面微观形貌。如图所示，未经处理的甘蔗渣原料表面光滑、结构紧密，这意味着酶难以进入甘蔗渣内部，导致水解得率低；而经单独过氧化氢或乙酸处理后，甘蔗渣表面一定程度被破坏，结构发生断裂，开始出现孔隙。但是经过氧化氢-乙酸联合预处理后，由于木质素的大量溶解，甘蔗渣表面出现孔隙率增加，比表面积增大，与纤维素酶的接触位点增多，这将会使酶可及度明显增加。

a.SCB; b.HP/70-SCB; c.AC/70-SCB; d.HPAC/70-SCB- 0.5

2.1.4疏水度和酶可及度 甘蔗渣预处理前后的疏水度和酶可及度变化如表3所示。由表可知，原料甘蔗渣的疏水度和酶可及度分别为0.173 L/g和63.34 mg/g，经单独过氧化氢或乙酸预处理的甘蔗渣疏水度和酶可及度变化不明显。然而，当采用过氧化氢-乙酸联合处理后，随着预处理温度的升高，底物疏水度呈下降趋势，而酶可及度呈上升的趋势，如HPAC/70-SCB的疏水度和酶可及度分别为0.067 L/g和84.54 mg/g，疏水度比HP/70-SCB和AC/70-SCB分别降低了57.86%和60.36%，酶可及分别度增加了45.58%和38.01%，这主要是因为木质素的大量脱除导致底物的亲水性增加，使底物更易于参与直接红染料的吸附。此外，当过氧化氢浓度降低至原来的1/2，预处理底物(HPAC/70-SCB- 0.5)的疏水度和酶可及度与HPAC/70-SCB相比变化不大，分别是0.067 L/g和80.30 mg/g，疏水度比HP/70-SCB和AC/70-SCB分别降低了57.86%和60.36%，酶可及度分别增加了38.26%和31.08%。酶可及度是影响酶解效率的关键因素之一，甘蔗渣的亲水性增加，对酶的吸附亲和力增强；木质素具有疏水性能，与纤维素酶存在疏水性结合，底物的疏水度增高，会使酶与碳水化合物的结合能力减弱[17]，其次木质素的脱除降低了酶的非生产性吸附，使更多的纤维素与酶发生吸附并进行酶解糖化反应。

表3 甘蔗渣预处理前后的疏水度及酶可及度

2.2 过氧化氢-乙酸联合预处理对甘蔗渣酶解和发酵的影响

2.2.1水解得率和纤维素酶的分布 对原料和预处理后的甘蔗渣加入酶，酶剂量为5 FPIU/g(基于底物)，进行72 h水解，不同时间点的葡糖糖得率、木糖得率和纤维素酶蛋白的分布如图2所示。从图中可以看出，SCB、HP/70-SCB、AC/70-SCB的葡萄糖、木糖得率较低，表明单独过氧化氢和单独乙酸预处理不能促进SCB的酶降解。然而，当对甘蔗渣进行过氧化氢-乙酸联合预处理后，酶解得率变化明显，水解72 h，预处理温度从30 ℃升高到70 ℃，HPAC/70-SCB的葡萄糖得率从16.83%提高到59.09%，木糖得率从16.77%提高到51.82%。与HP/70-SCB相比，其葡糖糖得率和木糖得率分别提高了3.64倍和4.43倍；与AC/70-SCB相比，分别提高了12.91倍和25.44倍。这表明过氧化氢-乙酸联合预处理可脱除甘蔗渣中大量木质素，使底物对酶的吸附能力增强，并使还原糖得率明显提升。此外，将过氧化氢浓度降低至原来的1/2，底物HPAC/70-SCB- 0.5的还原糖得率最优，葡糖糖和木糖得率分别是87.63%和62.78%，明显高于HPAC/70-SCB。主要是因为过氧乙酸的强氧化作用使纤维素表面乙酰化，阻碍了部分底物对纤维素酶的吸附，使还原糖的得率降低[18]。

在水解反应过程中，大量的酶蛋白先吸附到底物上，参与酶水解反应，使糖苷键断裂，再脱附到水解液中，整个酶水解过程酶在底物上呈现吸附-催化-解吸附-再吸附的过程[19]。在最开始的6 h内，所有底物水解上清液中的酶蛋白含量显著降低，然后缓缓上升。原料甘蔗渣72 h的水解上清液中酶蛋白质量分数为20.01%；单独过氧化氢处理和单独乙酸处理的甘蔗渣72 h水解上清液中酶蛋白质量分数分别为17.15%和16.90%，这表明SCB、HP/70-SCB、AC/70-SCB这3种底物对纤维素酶为不可逆的无效吸附，酶解反应结束后大量的酶蛋白被底物吸附，很难脱附到水解液中参加下一轮的酶解反应，因此糖化效率较低。底物HPAC/70-SCB- 0.5在反应开始的2 h内，纤维素酶快速吸附，水解上清液中的酶蛋白迅速减少到21.22%，反应结束时上清液中的酶蛋白为24.75%，与SCB、HP/70-SCB和AC/70-SCB相比，分别增加了23.69%、 44.31%和 46.45%，表明大量的纤维素酶脱附到上清液中，并再次参与到剩余底物的降解。这是因为HPAC预处理脱除了大量的木质素，从而减少了对酶的非生产性吸附，同时底物表面孔隙率增加，比表面积增大(图1)，促进酶水解反应的正向进行[20]。

a.葡萄糖 glucose; b.木糖 xylose; c.蛋白质 protein

2.2.2乙醇发酵 按1.3节操作，收集酶水解上清液，加入酵母溶液发酵24 h后，乙醇质量浓度和得率如表4所示。HP/70-SCB和AC/70-SCB的酶水解液经发酵后，其乙醇质量浓度分别为0.99和0.33 g/L，而经过氧化氢-乙酸联合预处理后的甘蔗渣水解液用于发酵，其乙醇质量浓度明显提升，且随预处理温度升高，乙醇质量浓度越大。HPAC/70-SCB- 0.5的乙醇质量浓度是7.57 g/L，分别是HP/70-SCB和AC/70-SCB的7.65倍和22.94倍。此外，与HPAC/70-SCB的乙醇质量浓度(6.67 g/L)和得率(57.09%)相比，分别提高了13.49%和10.54%，这是因为酶水解后HPAC/70-SCB- 0.5水解液的葡萄糖质量浓度为29.26 g/L，高于HPAC/70-SCB的23.33 g/L，在合适的发酵条件下酿酒酵母能高效地将水解液中的葡萄糖转化为乙醇，但是HPAC/70-SCB- 0.5的乙醇得率低于65%，主要是因为发酵液中的甲酸、乙酸质量浓度较高，分别为2.53和1.05 g/L，而酸类物质会引起甘蔗渣细胞质的酸化和去极化反应，使乙醇得率降低，在实际生产中可采用活性炭吸附、碱中和、微生物降解等脱毒手段来降低抑制物对乙醇发酵的影响[21-22]。

表4 预处理甘蔗渣水解液发酵的乙醇浓度和产量

3 结 论

3.1过氧化氢-乙酸联合预处理脱除了甘蔗渣的大部分木质素并使大部分纤维素得以保留。最优条件：20 g的甘蔗渣加入过氧化氢-乙酸溶液300 mL，其中过氧化氢(15%)溶液150 mL，乙酸(99%)150 mL，硫酸用量为0.5%(以过氧化氢-乙酸溶液总体积计)，在70 ℃反应2 h，甘蔗渣的木质素脱除率为88.85%，并有90.10%的纤维素保留。预处理后的甘庶渣HPAC/70-SCB- 0.5的疏水度和酶可及度分别为0.067 L/g和80.30 mg/g，疏水度比单独过氧化氢预处理(HP/70-SCB)和单独乙酸预处理(AC/70-SCB)降低了57.86%和60.36%，酶可及度增加了38.26%和31.08%，木质素表面覆盖率由原料的0.66降低到0.22，碳水化合物暴露在表面，孔隙率增加，比表面积增大。

3.2HPAC/70-SCB在酶用量为5 FPIU/g(以底物计)时进行水解，其葡萄糖得率为59.09%，纤维素表面的乙酰化可能是导致酶解得率低的原因，降低预处理中过氧化氢浓度为原来的1/2，即过氢化氢体积分数为15%时，HPAC/70-SCB-0.5酶解得率明显提高，其葡萄糖得率为87.63%，发酵产乙醇质量浓度为7.57 g/L。