低温等离子体在口腔微生物感染性疾病中的应用研究进展

孙小钦，王 旭，韩 琪,3，陈 宇,3△

(1.口腔疾病研究国家重点实验室，国家口腔疾病临床医学研究中心，四川大学华西口腔医学院，四川成都610041；2.四川大学机械工程学院，四川成都610041；3.四川大学华西口腔医院口腔病理科，四川成都610041)

口腔富含微生物，口腔微生物组是“表示共生，和病原微生物共生的生态群落，实际上共享我们的身体空间，为健康和疾病的决定因素”，当口腔微生物群失去稳态时会导致一系列微生物感染性疾病[1]。免疫系统可协调维持宿主与微生物之间的平衡，但找寻一种新型的口腔抗感染方法是当前该领域的研究方向。20世纪90年代，等离子体抗菌在医用研究上取得很大进度。低温等离子体(cold atmospheric plasma, CAP)通过向气体提供能量诱导电离产生，形成活性氧和氮物质(reactive oxygen and nitrogen species ，RONS)等部分电离气体[2]。当微生物直接暴露于CAP时，RONS综合协同作用灭活[3]。CAP可调节与氧化还原信号相关的多个细胞过程，活性氧(reactive oxygen species，ROS)的变化会触发氧化还原敏感转录因子协同作用[2]，促进有微生物导致的口腔创伤感染愈合。该文对CAP在口腔微生物感染性疾病中的应用做一概述。

1 CAP防治龋病应用

龋病与口腔微生物群落生态失调密切相关，膳食碳水化合物代谢持续产酸导致耐酸微生物增加，改变牙体硬组织表面pH稳态，打破脱矿-再矿化平衡[4]，导致牙无机物脱矿、有机物分解而形成龋。

1.1 CAP与口腔龋病相关浮游微生物等离子体应用牙科抗菌研究始于20世纪初期[2]。CAP对接种在不同介质(多孔介质如滤纸，光滑固体表面介质如载玻片，聚合物表面介质如牙釉质类似物)的变异链球菌和嗜酸乳杆菌均有较好的杀菌效果，但嗜酸乳杆菌的灭活时间比变异链球菌长。嗜酸乳杆菌的直径比变异链球菌大，具有更高的等离子体耐受性，为了使单个细胞达到相同强度的等离子体射流，在相同条件下，CAP处理嗜酸乳杆菌的时间会更长。其次是在相似细胞群密度下，嗜酸乳杆菌的细胞层重叠比变异链球菌更多，CAP的活性物质被细胞外层阻挡而无法到达细胞的下层。革兰氏阳性菌对CAP治疗的敏感性低于革兰氏阴性菌，这可能是由于革兰氏阳性菌的肽聚糖层厚而坚韧。CAP中的活性物质可以破坏革兰氏阳性细菌肽聚糖结构中的键和导致革兰氏阴性细菌膜的脂质过氧化[5]。

1.2 CAP对生物膜的作用牙菌斑生物膜在龋病的发生上有重要作用。研究[6]发现氩/氧CAP处理2分钟后显著降低了血链球菌单一菌种和双菌种生物膜中细菌的活力，降低幅度高达99%，其机制是通过降低细菌活力以及疏水性和共聚集能力来有效地灭活口腔细菌生物膜。氮基CAP处理后，羟基磷灰石盘(HA)上由人工唾液包被培养的生物膜被杀灭，同时HA表面形成具有羟基的新化合物，增加了表面的亲水性，可能影响细菌的粘附和生长速度[7]。CAP对生长在修复树脂复合材料表面的生物膜有抗菌效果，作用150秒后，细菌活力降低38.3%，同时能立即降低未破坏生物膜的代谢活性[8]。但生物膜去除方面存在局限性，其厚度可以减少CAP进入，防止CAP渗透到深层及对生物膜底部细菌的杀菌作用。此外，牙菌斑生物膜破坏程度与菌种组成和CAP气体成分有相关性。

1.3 CAP与牙体硬组织再矿化提高牙齿再矿化能力也是防治龋病的有效手段，氟化物可以增强牙釉质的再矿化、抗菌、抗腐蚀。CAP处理后牙齿表面氟化物的保留改善，CAP和氟化物联合治疗组的牙釉质含氟量和钙磷都比CAP未处理组高，说明CAP处理牙齿表面后对氟化物的吸收增加，提高了氟化物在牙釉质上的滞留率，导致牙釉质表面酸溶解度和脱钙降低。氟化钙样沉积物在口腔的停留时间较短，而CAP处理后，作为活性氧物质的羟基自由基与牙齿表面相互作用改变表面特征，形成氟化钙抑制牙釉质表面矿物质溶解。类釉质HA经过CAP处理后，氟保留得到改善，这可能与抗菌和抗生物膜作用增加相关[9]。CAP具有生物膜调节和氟化强化牙釉质双重作用，可以预防和治疗龋病。

2 CAP在牙髓炎和根尖周炎中的应用

根尖周病和牙髓疾病与口腔微生物感染密切相关，牙髓复杂的根管解剖结构和个体间牙本质小管形态的差异让次氯酸钠和氯己定对根管系统的所有部分充分消毒进行困难[10],CAP能深入到常规操作不能达到的根管腔隙中。

2.1 CAP对粪肠球菌的作用在牙髓感染和慢性根尖周炎中，粪肠球菌常被分离出来[11]。CAP对粪肠球菌浮游培养物具有良好的杀菌效果，且CAP处理时间变长时进一步提高了杀灭效果。CAP对年轻或者成熟(培养48小时或72小时)的生物膜具有显著抗菌功效，通过核酸释放的光谱测量发现处理后细胞质膜没有损伤，表明CAP主要作用机制似乎不是膜损伤。氦/氧等离子体对粪肠球菌生物膜的杀菌作用强于纯氦等离子体[12]。在次氯酸钠使用后辅助使用CAP处理粪肠球菌生物膜，与单用次氯酸钠显示出相似的抗菌效果，均比单独使用CAP有效[13]。

2.2 CAP与其他根管感染相关微生物灭菌后的离体牙根管内培养白色念珠菌—感染根管内最常见的真菌，发现单用CAP杀灭白色念珠菌的效果好过次氯酸钠和氯己定[14]。在无菌牛牙本质盘上培养来自人牙根管感染的多菌种细菌，证实CAP与氯己定对混合菌种生物膜的杀菌具有协同作用。通过分析CAP在不同深度感染根管中的杀菌效果，发现CAP与氯己定组合使用在整体消毒和根管0～300 μm层内更有效[15]。但实际情况下根管内的感染为多菌种的复杂感染，CAP对根管多菌种生物膜处理效果如何有待进一步研究。

2.3 CAP对根管材料的作用Bisag等[16]用氦等离子体对预备好的离体牙根管处理180秒后，直接使用牙胶尖充填，通过共焦显微镜分析发现CAP处理提高了牙胶尖向牙本质小管的扩散和渗透程度。同时CAP处理后环氧树脂基纤维桩和充填树脂之间的粘合增加，其原理可能是CAP改变其表面性质[17]，强调了在根尖封闭中避免使用具有细胞毒性的根管封闭剂的可能性，提示CAP辅助根管治疗的应用潜力。

3 CAP在牙周病中的应用

牙周和牙髓组织两个部位的微生物群之间存在相似性,但牙周微生物群变动复杂和多样化。牙周炎由多种微生物的协同作用和宿主的免疫反应，导致牙周组织进行性破坏[18]。

3.1 CAP与牙周炎感染相关微生物牙周炎生物膜相关的的致病因素包括牙龈卟啉单胞菌、齿状密螺旋体和连翘革兰氏菌[18]。CAP对牙龈卟啉单胞菌具有显着的剂量相关灭活作用，暴露时间越长，细菌抑制区越大。而牙龈卟啉单胞菌生物膜具有多层结构，通过逐层扫描，发现厚度约15 μm，相当于30层牙龈卟啉单胞菌，但CAP可以穿透15 μm的生物膜，有效抑制牙龈卟啉单胞菌[19]。

3.2 CAP在牙周炎中对组织修复作用骨重塑阶段是通过骨形成和骨吸收之间的平衡进行管理，其中，成骨细胞在这些过程中发挥重要的关键作用并产生多种蛋白质，如碱性磷酸酶、骨钙素和I型胶原蛋白，它们可以刺激新骨形成。CAP有形成RONS获得杀菌和促进成骨细胞分化等特性，实验[20]发现CAP处理后增加大鼠成骨细胞活性并降低破骨细胞活性，同时骨钙素和碱性磷酸酶抗体的免疫反应性增加。CAP刺激引起的机械负荷和电刺激等物理压力可能会诱导细胞增殖并促进骨再生。还有实验[21]分析CAP影响人成骨细胞样细胞(MG63)基因和蛋白质调节，与未处理的细胞相比，处理组关键凋亡标志物p53、凋亡蛋白酶激活因子-1、半胱天冬酶9和半胱天冬酶3的表达显著下调，CAP对凋亡基因有抑制作用。通过评估应用CAP与牙根平整术对牙周炎患者临床效果研究，发现CAP作为辅助治疗增加了牙齿的临床附着水平，并有效减少牙周病原体重新定植。以上研究可以认为CAP具有通过炎症反应调节、成骨细胞分化和减少牙槽骨丢失来加速治疗牙周炎的临床潜力。

4 CAP与种植体周围炎

种植体周围炎指伴有支持骨丢失的种植体周围组织的炎症反应，是种植体失败的重要危险因素之一[22]。

4.1 CAP与种植体周围炎感染相关微生物研究[3,23,24]发现CAP处理不同材质(钛，氧化锆)的种植体后，牙龈卟啉单胞菌在其表面的粘附和生长得到抑制，有效减少生物膜，同时对牙龈上皮细胞无明显细胞毒性，与氯己定、激光等方法对比时显示了更好的效果。氦气CAP处理氧化锆表面后，ROS抑制变异链球菌生长，处理的时间依赖性有效性取决于CAP处理后氧化锆在不同储存时间下的表面特性和抗菌功效的变化。尽管60秒CAP处理的氧化锆的抗菌效果随着时间的推移降低，但14天后处理表面上的细菌比未处理表面上的细菌要少，氧化锆圆盘仍然具有一定的抑菌能力，通过活性氧染色分析，验证了其抑菌能力是残留在氧化锆表面的ROS对细菌施加氧化应激，导致其死亡[25]。

4.2 CAP与种植体表面改性氧化锆基台通过CAP处理后材料表面的亲水性增加，表面形貌未变，但钛表面经过处理后粗糙程度得到提高，促进成骨细胞的粘附、增殖和分化[26]。空气CAP 对人类牙周细胞、成纤维细胞、成牙骨质细胞和成骨细胞样细胞具有良性刺激作用，促进其在种植体表面的增殖、黏附，提示CAP治疗提供的愈合能力可以增强牙种植体的骨整合，这可能是由于水接触角减小和表面官能团存在氧，和/或碳污染水平降低[27,28]。通过增强钛基台上的种植体周围软组织密封，防止口腔环境感染，减少种植失败，CAP有可能成为种植体周围炎治疗的有效选择，但关于CAP对种植体周围炎的作用研究多为体外研究或动物研究，并不完全符合口腔的真实情况。

5 CAP促进口腔伤口愈合

增加活性氧可以促进血管内皮生长因子的释放和伤口愈合[29]。RONS可以灭活细菌，提高组织中的血氧水平，加速愈合过程。

5.1 CAP通过抗菌促进口腔伤口愈合微生物感染严重阻碍或延缓愈合过程，慢性伤口的微生物常具有耐药性，包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)，铜绿假单胞菌等。以氯己定作为阳性对照，发现不同气体(氩气，氩气和氧气混合物)的CAP对铜绿假单胞菌生物膜的治疗效果至少与氯己定处理一样有效，甚至更好，具体取决于气体、菌种组成和暴露时间[30]。CAP对小鼠感染伤口进行治疗时，提高了抗生素的有效性并降低了灭活MRSA生物膜所需的抗生素浓度，同时CAP治疗与抗生素相结合可以有效地减少体外和小鼠伤口模型中的生物膜[31]。

6 结语

由于其抗菌性能、促进伤口愈合和生物安全性，CAP在口腔医学领域具有广阔的应用前景。目前CAP在口腔医学的应用仍停留在研究阶段以及临床的初步实验，实际应用于口腔临床还需要更深入的研究。作为一项新技术，CAP也存在一些缺点，装置的成本及其维护是目前很受关注的问题，设备的便携性也是牙科应用中的一个关注点。这些问题都有待未来的技术革新解决。