喷施外源EBR和H2O2对烤烟幼苗抗低温胁迫的影响*

2022-07-28沈子奇向世鹏许金亮张芸萍谢鹏飞

云南农业大学学报(自然科学) 2022年4期

沈子奇，向世鹏，许金亮，范敏，张芸萍，谢鹏飞，李强

(1.湖南农业大学农学院，湖南长沙 410128；2.湖南省烟草公司长沙市公司，湖南长沙 410021)

烟草是常见喜温作物，多在春季移栽。近年来，为适应新的栽培制度，烤烟移栽期时常提前，因而容易出现早期烟草幼苗受低温胁迫所导致的营养生长不足，生殖生长提前，烟株矮小早花，叶片小且叶数少，从而造成烟叶产量品质降低[1]。研究表明：植物受低温胁迫时，会通过抗氧化酶系统清除活性氧或减少活性氧产生，以维护细胞质膜、蛋白质及核酸等生物大分子稳定，降低活性氧损伤[2]；也会通过大量积累细胞中的渗透调节物质，如脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖等增强对低温胁迫的抵抗能力[3-4]。常博文等[5]研究证实：施用外源物质(如赤霉素、水杨酸和多胺等)可提高作物耐性，从而缓解低温胁迫对作物造成的损伤。通过施用外源物质缓解烟草幼苗在大田早期受到的低温胁迫对烤烟栽培同样具有重要意义。

表油菜素内酯(epibrassinolide，EBR)在植物响应逆境胁迫中发挥着重要作用。大量研究表明：EBR可以缓解植物因多种逆境胁迫带来的损伤，如盐胁迫、干旱胁迫、高温或低温胁迫、重金属胁迫、弱光胁迫和生物胁迫等[6-10]。聂文婧等[6]研究发现：EBR可显著提高NaHCO3胁迫下黄瓜叶片和根系的抗氧化酶活性，维持植株内氧化还原平衡，提高植株耐盐性；丁丹阳等[7]研究表明：喷施外源EBR能够促进根系形态发育，提高抗氧化酶活性，降低活性氧积累和膜质过氧化水平，提高光合能力，增强烟草的抗旱能力。EBR能改善植物生长发育，增强植物对逆境的耐受性，降低因胁迫造成的损失，且其在改善植物生理活性方面的表现优于现有的5种植物激素[11]。低含量的外源H2O2作为一种植物信号分子，参与调控植物体内多种生理代谢过程和众多基因表达[12]，可提高植物对逆境胁迫的耐受能力。有研究表明：H2O2处理可显著增强盐胁迫下草莓叶片中抗氧化酶的表达水平，提高叶片光合能力以抵抗胁迫[13]；也有研究表明：施用H2O2可以提高水稻幼苗的抗氧化活性以缓解Cd胁迫[14]。

目前关于施用外源EBR和H2O2对植物抗逆性作用的报道主要集中于植物受胁迫后的缓解效应，而对其施用的保护效应研究则鲜有报道。本研究以低温敏感型烤烟K326和新品种烤烟湘烟7号为材料，研究低温胁迫对烟草生理和生长的影响以及外源EBR和H2O2对烟草的保护效应，以期为化学调控技术在烟草抗逆栽培中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试烤烟品种为K326和湘烟7号，均来自湖南省烟草种质资源管理库；植物生长外源物质为0.01 mg/L EBR和340 mg/L H2O2，购自上海易恩化学技术有限公司，两者的质量浓度由预试验确定。

1.2 试验设计

取饱满一致的烤烟种子依次放入50 ℃温水浸泡10 min、75%乙醇溶液浸泡30 s和10%NaClO溶液浸泡10 min (每次浸泡后均用无菌水洗净)后点播于已经用1/4霍格兰营养液完全浸湿的脱脂棉培养皿上，每皿50～60粒，置于28 ℃人工气候箱中避光催芽4 d，取萌动一致的种子播种于育苗盘，每盘播种24株，后将人工气候箱设置为光照时长14 h/10 h(昼/夜)、昼/夜温度28 ℃/18 ℃、相对湿度75%和光照强度7 000 lx；待烟苗长至七叶一心时，K326 (T1～T4)和湘烟7号(T5～T8)各设置4个试验处理。T1和T5：连续4 d喷施EBR，转入低温胁迫4 d后恢复常温；T2和T6：连续4 d喷施H2O2，转入低温胁迫4 d后恢复常温；T3和T7(阴性对照)：连续喷施4 d蒸馏水，转入低温胁迫4 d后恢复常温；T4和T8(阳性对照)：连续喷施4 d蒸馏水，始终保持常温生长。其中，EBR和H2O2的喷施量约为每株5 mL (使药液浸润叶面)，喷施时间为9：00和14：00；每个处理重复3次，每个重复8株。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 农艺性状及生物量

低温胁迫结束后第8 天，分别取各处理植株自上而下第 2、3 片真叶，测量其最大叶长和最大叶宽，并称量各处理地上和地下部烟株鲜质量，后将烟苗105 ℃杀青40 min，于80 ℃恒温箱中烘干至恒质量，称量各样品干质量。计算最大叶面积(最大叶长×最大叶宽×0.634 5)和根冠比(根部干质量/地上部干质量)。

1.3.2 抗氧化酶活性、MDA及渗透调节物质含量

烟株低温处理4 d后，取自上而下第2、3片完全展开叶测定各项指标。采用MUZI等[15]的方法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性；采用FOYER等[16]的方法测定过氧化物酶(POD)活性；采用秦文芳等[17]的方法测定过氧化氢酶(CAT)活性和MDA含量；游离脯氨酸含量使用南京建成生物工程所有限公司试剂盒检测；可溶性糖含量采用蒽酮比色法测定[18]；可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝法测定[17]。

1.4 数据分析

采用 SPSS 21.0 和 Origin 2018 软件进行数据处理和绘图，采用 Duncan’s 新复极差法进行多重比较(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 低温胁迫对喷施2种外源物质后烤烟幼苗农艺性状及生物量的影响

2.1.1 农艺性状

由表1可知：经低温胁迫后，2种烤烟的各项农艺性状均下降。相比于T4和T8，T3和T7的最大叶长、最大叶宽和最大叶面积分别下降27.80%、26.42%、46.95%和30.75%、30.53%、51.89%，表明低温对2种烤烟的生长均产生显著的抑制作用。与T3相比，T1和T2的最大叶长分别提高16.41%和13.90%，最大叶宽分别提高19.65%和20.19%，最大叶面积分别提高39.34%和36.88%，且差异均达到显著水平，而T1和T2间差异不显著。T5、T6和T7之间的各项农艺性状指标差异均未达显著水平。说明低温胁迫前喷施2种外源物质有助于减轻K326受低温胁迫后对叶片生长的抑制，从而加强K326对低温的耐受性，但2种外源物质的效果没有显著差异；而湘烟7号叶片生长受低温胁迫抑制的程度不随喷施2种外源物质而发生显著变化。

表1 不同外源物质对低温胁迫下2种烤烟幼苗农艺性状的影响Tab.1 Effects of different exogenous substances on the agronomic traits of two types of tobacco seedlings under low temperature stress

2.1.2 生物量

由表2可知：经低温胁迫后，2种烤烟的鲜质量、干质量和根冠比均下降。T3较T4的地上部干质量和鲜质量分别下降42.62%和28.49%，根干质量和鲜质量分别下降66.67%和49.62%，根冠比下降55.00%；T7较T8的上述指标分别下降42.62%、22.58%、50.00%、33.81%和15.00%。就K326而言，T1和T2的地上部和根干、鲜质量以及根冠比均显著高于T3；就湘烟7号而言，T6的地上部和根干、鲜质量和根冠比与T7相比差异不显著；T5的根干、鲜质量和根冠比都显著高于T7，分别高16.67%、16.30%和11.76%。说明在低温前喷施2种外源物质都能缓解低温胁迫下2种烤烟的生物量损失，且以喷施EBR的效果更为明显；而2种烤烟中K326的生物量受低温胁迫影响更大，2种外源物质对其保护效果也更为明显。

表2 不同外源物质对低温胁迫下2种烤烟幼苗生物量的影响Tab.2 Effects of different exogenous substances on the biomass of two types of tobacco seedlings under low temperature stress

2.2 低温胁迫对喷施2种外源物质后烤烟幼苗抗氧化酶活性的影响

2.2.1 超氧化物歧化酶(SOD)活性

由图1可知：低温胁迫后，T3的SOD活性显著低于T4，而T1和T2的SOD活性比T4分别高13.51%和16.77%；T8的SOD活性比T7低12.85%，T5和T6分别较T8高4.28%和7.93%，但未达到T7的SOD活性水平。说明喷施2种外源物质可以提高K326在受低温胁迫后的SOD活性，增强其活性氧清除能力，且喷施H2O2的保护效果更佳；而湘烟7号在受低温胁迫后出现SOD活性显著上升的现象可能与其品种耐冷特性有关。

2.2.2 过氧化物酶(POD)活性

由图1还可知：低温胁迫后，与T4相比，T3的POD活性下降12.50%；与T3相比，T1和T2的POD活性分别显著提高107.14%和85.71%；T7的POD活性比T8低47.62%，T6的POD活性比T7高50.00%，但T5的POD活性反而比T7低22.72%。说明低温胁迫前喷施2种外源物质均可以提高K326在低温胁迫后的POD活性，且EBR的效果更好；但仅喷施H2O2可以提高低温胁迫下湘烟7号的POD活性。

2.2.3 过氧化氢酶(CAT)活性

由图1可知：低温胁迫均导致2种烤烟CAT活性下降，且对K326的影响达显著水平，T3的CAT活性比T4低25.95%；而对湘烟7号影响较小，T7的CAT活性比T8仅低5.58%，未达到显著水平。与仅低温胁迫相比，在低温胁迫前喷施外源物质均可提高2种烤烟的CAT活性，T1和T2的CAT活性分别比T3高43.81%和47.42%；T5和T6的CAT活性分别比T7高 5.91%和32.27%。说明在低温胁迫前喷施2种外源物质都能降低低温胁迫对2种烤烟CAT活性的影响，且喷施H2O2的效果更为明显，其中，K326的CAT活性受低温胁迫影响更大，2种外源物质对其保护效果更为明显。

图1 不同外源物质对低温胁迫下2种烤烟幼苗抗氧化酶活性的影响Fig.1 Effects of different exogenous substances on the antioxidant enzyme activities of two types of tobacco seedlings under low temperature stress

2.3 低温胁迫对喷施2种外源物质的烤烟幼苗渗透调节物质和丙二醛(MDA)含量的影响

由表3可知：喷施2种外源物质后，2种烤烟的可溶性蛋白含量变化相反，T5和T6分别较T7低6.67%和13.33%，T1和T2均较T3高7.14%。就可溶性糖含量而言，T1和T2分别比T3显著高76.95%和54.13%，且显著高于T4；T5、T6和T7的可溶性糖含量无显著差异，但分别比T8显著高20.80%、27.04%和21.30%。T1和T2的脯氨酸含量分别比T3显著高22.88%和35.46%；T5、T6和T7的脯氨酸含量无显著差异，但均显著高于T8。T1和T2的MDA含量比T3显著低31.52%和42.93%；T5、T6和T7的MDA含量没有显著差异。

表3 不同外源物质对低温胁迫下2种烤烟渗透调节物质和丙二醛含量的影响Tab.3 Effect of different exogenous substances on the osmoregulatory substances and MDA content of two tobacco under low temperature stress

3 讨论

烤烟对低温胁迫的响应主要表现在细胞膜系统、保护酶活性、渗透调节物质和代谢活性等4个方面[19]，本研究从细胞膜系统、保护酶活性和渗透调节物质3个方面分别选取具有代表性的指标，配合植株的生物量变化，探讨低温胁迫前喷施2种外源物质对2种烤烟幼苗的保护效果。受低温胁迫影响，烤烟幼苗生理和代谢过程出现异常，导致其形态和结构发生变化[20]。本研究对烤烟幼苗干物质量和根冠比等形态结构指标进行测定，表明低温胁迫前喷施EBR和H2O2均有利于提高烤烟幼苗耐低温胁迫的能力，且喷施EBR的处理耐受性更强。同时，通过对比2种烤烟相同低温胁迫下生长(生物量)受抑制的程度，证实湘烟7号耐低温胁迫的能力较K326强。与K326相比，低温胁迫下湘烟7号的叶面积减小更明显，这可能是由于湘烟7号能通过减小叶面积的方式减少气孔密度，以削弱低温胁迫造成的伤害[21]。

MDA含量可用于综合评价细胞受胁迫时生物膜的损伤程度[22]。有研究表明：低温胁迫下烤烟幼苗MDA含量随胁迫程度的增强而明显上升[23]。本研究中，低温胁迫下2种烤烟的MDA含量较常温有所上升，这与前人研究结果一致。与阴性对照相比，喷施EBR和H2O2处理的K326 MDA含量明显下降，说明适宜质量浓度的EBR和H2O2可通过提高烤烟幼苗生物膜系统对低温胁迫的耐受性进而提高其耐低温胁迫的能力；而喷施外源EBR和H2O2处理的湘烟7号MDA含量变化不显著，这可能是由于湘烟7号受低温胁迫后MDA含量仍然较低所致[23]。

当植物处于低温逆境时，会在短时间内产生大量O2·-，导致ROS积累，打破体内ROS代谢平衡，对细胞造成氧化伤害[24]。此时，植株会自发提高抗氧化酶活性以应对大量生成的O2·-，其中，SOD可以催化O2·-生成H2O2和O2，POD和CAT又对H2O2进行分解[25-26]。本研究中，与阴性对照相比，低温胁迫前喷施外源EBR和H2O2可使K326的SOD、POD和CAT活性显著上升，也证明喷施2种外源物质均有保护效果；但湘烟7号的抗氧化酶活性变化规律不一致，其原因可能是：处于低温逆境中的植物，耐寒性较差的品种其抗氧化酶活性升高趋势明显，而耐寒性较好的品种其抗氧化酶活性能在低温持续阶段甚至后续恢复温度阶段始终保持一定[27]。此外，湘烟7号的POD活性在受到低温胁迫后大幅下降，这一现象仍有待进一步研究。

烤烟生长受低温胁迫的抑制，其植物组织通常会降低渗透势以适应环境。植物体内的渗透调节物质包括可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸等[20]，这些渗透调节物质与植物的耐冷性有关，如受低温胁迫时，植株体内的可溶性糖积累用以增加组织中的非结冰水，降低细胞水势，增强持水力[28-29]。本研究中，低温敏感型品种K326受低温胁迫后，可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量均降低，表明低温胁迫已经损伤烤烟幼苗细胞，导致细胞水势失衡；而在低温胁迫前喷施外源EBR和H2O2可以显著提高其3种渗透调节物质的含量，说明适宜质量浓度的EBR和H2O2可以通过提高烤烟幼苗渗透调节物质含量帮助烤烟抵御低温胁迫。