不同方法处理对栀子属植物花粉形态的影响

夏诗琪，陈宜均，李 婷，李康琴，邓绍勇★

(1.江西省林业科学院，江西 南昌330013；2.国家林业草原栀子工程技术研究中心，江西 南昌330013)

植物花粉是携带大量的遗传信息的雄性生殖细胞，是植物生长、遗传、变异的基础[1-2]。花粉形态具有很强的遗传保守性和稳定性，其固有的轮廓，纹饰，萌发孔数目、位置等特征反映物种独特的生物信息，利用这些固有特征进行分类鉴定，具有十分重要的科学价值[3-4]。国内外的许多学者对肉苁蓉（Cistanche deserticola）、桉树（Eucalyptus robusta）、泡桐（Paulownia fortunei）等花粉形态进行了观察，为品种的分类鉴定、亲缘关系等提供了数据支撑[5-7]。花粉粒体积小，单纯通过普通光学显微镜无法观察到花粉的外壁纹饰，而外壁纹饰多样，是植物分类及鉴定的重要性状[8-9]。因此具有高分辨率、直观立体的扫描电镜是研究花粉形态的重要工具。用扫描电镜观察时，最好用新鲜的花粉制备样品，但是由于制样时间长，花粉离体时间太久会影响花粉的微观形态[10-11]，因此选用合适的电镜样品制备方法尤为重要。通过查阅文献，常用的电镜样品制备方法有常规生物电镜制备、直接干燥法制备、导电双面胶带拉断法、新鲜材料直接喷金等。导电双面胶带拉断法可以观察到花粉内部，但是对操作人员的技术要求严格[12]。新鲜材料直接喷金操作简单、节约时间，然而在样品制备过程中可能影响花粉形态[13]。常规生物电镜制备、直接干燥法制备最常用，因此该研究采用这两种方法制备样品，研究两种不同制样方法处理的效果，以期为相关研究人员在花粉电镜样品制备方法的选择上提供参考。

全世界栀子属(Gardenia)植物约250 种，分布于东半球的热带和亚热带地区。我国栀子属植物种类较少，有6 种、1 变种，其中栀子(G. jasminoides)广泛分布于长江以南各省区，其他种野生分布区极其狭窄。近年来，本课题组采用数量分类、分子标记等方法对栀子属栽培品种与近缘种进行分类研究[14-15]，然而，目前国内几乎没有对不同类型栀子花粉的形态研究。作者以金福水栀（G. jasminoides‘Jinfu’）、狭叶栀子（G. stenophylla）、栀子和荷花栀子（G. jasminoides‘Hehua’）4 种栀子属植物[16]的花粉为实验材料，采用常规生物电镜制备和直接干燥法制备扫描电镜样品，观察了4 种栀子花粉的微观形态，为栀子花粉形态研究、本属植物系统分类、亲缘关系和系统演化方式提供重要依据。

1 材料与方法

1.1 材料

4 种栀子属植物金福水栀、狭叶栀子、栀子和荷花栀子来自江西省林业科学院内的栀子种质资源基因库基地。2020年5 月下旬剪取即将开放的4 种栀子属植物的花枝，带回实验室进行隔离水培，待花朵开放后取花粉进行后续处理。

1.2 方法

1.2.1 常规生物电镜样品处理

取上述4 种栀子的花粉各1 份，分别装在4 个离心管中, 各加入1.8 mL 戊二醛溶液(2.5%、pH=6.8)，4℃固定过夜；2000 r·min-1离心30 s，去掉上清液；于室温条件下，用0.1 mol·L-1的磷酸缓冲液(pH=7)漂洗沉淀物3 次，每次15 min；然后采用乙醇梯度洗脱法将样品脱水处理（乙醇浓度分别为30%、50%、70%、80%、90%、100%），每个浓度处理15 min；用适量纯丙酮处理2 次，每次20 min；样品在通风橱中吹干去除残留的丙酮；最后将花粉样品用滤纸密实包裹，置于干燥器内干燥。待花粉完全干燥后，制备电镜样品，步骤如下：用大小合适的导电胶带轻轻粘取少量的花粉，吹掉表面未粘牢的多余花粉，避免花粉堆积影响电镜观察。

1.2.2 直接干燥电镜样品处理

取金福水栀、狭叶栀子、栀子和荷花栀子4 种栀子的花粉各1 份，将花粉样品用滤纸密实包裹，于干燥器中干燥。待花粉完全干燥后，制备电镜样品，制备步骤同1.2.1。

1.2.3 电镜观察

将导电胶未粘住花粉的一面粘在样品台上，喷金处理后，用JFC-1600 型扫描电镜观察花粉的微观形态。

2 结果与分析

2.14 种栀子花粉结构形态分析

花粉形态和大小比较：植物花粉可以分为单粒花粉和复合花粉（包括2 合、4 合、16 合等），栀子属4 个种的花粉均为四合花粉，呈正四面体紧密排列（图1）。极面观可见1 粒在上，3 粒在下（图1：A3、C3、E3、G3）；赤面观两粒在上，2 粒在下（图1：A4、C4、E4、G4）。4 种栀子花粉四合体缝均较深，单粒花粉为球形或者近球形，四合花粉的相邻单粒花粉孔相连，具3孔，呈120°等距离排列，呈裂缝状，可见沟内有萌发孔（图1：C5），孔边加厚。4 种栀子花粉形态无明显差异，但是花粉大小和萌发孔尺寸有差异。狭叶栀子（39.5～40.4 μm×42.0～43.6 μm）花粉粒最大，其次是荷花栀子（35.2～38.6 μm×39.8～41.8 μm）、栀子（33.2～34.6 μm×36.0～41.6 μm）、金福水栀（35.2～36.0 μm×36.8～38.5 μm）。栀子萌发孔窄且长，荷花栀子萌发孔短且宽，金福水栀和狭叶栀子的萌发孔大小居中。虽然花粉和萌发孔大小存在差异，但是这种差异不显著，不足以作为种间和品种间的分类标准。

花粉外壁纹饰差异比较：栀子属4 个种的花粉虽然在形状、结构上极为相似，但是外壁纹饰上存在一定差异。在放大1800 倍的扫描电镜下，可观察到花粉表面有细密瘤状颗粒突起，形状大小不一（图1：A5、C5、E5、G5）；栀子花粉外壁瘤状颗粒较小、致密、均匀，荷花栀子花粉外壁瘤状颗粒较大、稀疏、不均匀。

总之，这4 种栀子花粉的形状、结构很相似，具有属的共同特性。但是在花粉粒大小，萌发孔的长度和宽度、表面瘤状颗粒大小上存在差异。本研究认为，花粉粒大小、萌发孔的长度和宽度等差异不显著，栀子花粉外壁纹饰差异明显且直观；外壁纹饰可作为重要的孢粉学指标之一，用于分析栀子属植物分类情况。

2.2 两种不同方法处理的效果分析

整体上，可以看到两种不同方法处理的栀子属植物花粉结果存在明显差异。采用常规生物电镜样品制备方法制备的栀子属花粉粒饱满、无皱缩变形，萌发孔清晰可见，外壁瘤状颗粒均匀，纹饰明显（图1：A1-A5、C1-C5、E1-E5、G1-G5）。采用直接干燥处理的栀子属花粉粒仍具有四面体结构，极面观1 粒在上，3 粒在下（图1：B3、D3、F3、H3），赤面观2 粒在上，2 粒在下（图1：B4、D4、F4、H4）。然而单粒花粉明显塌陷、皱缩、变形，四合体缝加深，萌发孔由于挤压呈闭合状态，外壁瘤状颗粒变大、粗糙且不均匀。

图1 不同方法处理下4 种栀子花粉形态扫描电镜结果Fig. 1 SEM images of pollens of 4 Gardenia species under different treatments

3 讨论

被子植物的种类远较裸子植物的多，因而花粉类型也更为多样化，根据花粉粒的存在形式，有无萌发孔，以及萌发孔的形态、位置、数目等特征，可分为复合花粉、具多孔沟、具散孔等十几种[17]。本研究经扫描电镜观察，4 种栀子属植物金福水栀、狭叶栀子、栀子和荷花栀子的花粉形态为四合花粉，正四面体结构，花粉为近球形或球形，具3 孔，表面具瘤状颗粒突起，其轮廓形态特征基本一致。植物花粉形态通常是由基因控制，受到环境各因子的影响很小，相对比较稳定。本研究4 种栀子花粉外观形态无明显差异，差异体现在花粉大小上，该差异较小，无法作为分类标准，究其原因，一是所测量的种和个体较少，无法代表群体表现，二是电镜拍摄花粉的极面不完全一致，三是与花粉新鲜程度、处理时间长短、处理方式有关。然而栀子花粉外壁纹饰差异明显，可以通过外壁纹饰分析栀子属植物分类情况。因此，外壁纹饰可作为重要的孢粉学指标之一，这与张雅琼[18]等人的研究结果一致。

扫描电镜由于具有高分辨率，图像立体直观等优点，已被广泛运用于植物孢子微观形态的观察[19]。对花粉的干燥处理是样品制备的关键，直接影响扫描电镜的结果。对于某些外壁较厚且含水量低的花粉，采用操作简单的干燥处理法即可满足研究需要。而本研究中，相比于常规生物电镜样品制备方法，直接干燥方法处理发现花粉形态、萌发孔、外壁纹饰均有不同程度的变形，会严重影响观察者对花粉真实形态及差异性的分析。栀子属花粉外壁薄且含水量高，直接干燥过程中水分会迅速流失，受到表面张力的作用，其表面结构易发生塌陷、皱缩和变形[7]。常规生物电镜样品制备方法能将脱离了植物体的花粉及时用戊二醛固定处理，消除表面张力的影响，避免失水变形，以更好的维持花粉的微观结构[20]。不同种类植物花粉的外壁厚度和含水量差别较大，扫描电镜样品制备应根据花粉的自身特性个性化制定，某些壁软且薄的花粉容易变形，建议大批量制备电镜样品前，用常规生物电镜样品制备方法制样观察对比有无变形，避免实验材料的浪费和实验结果的误差。