普通油茶WOX 基因家族的鉴定及表达分析

赵松子，幸伟年

（江西省林业科学院·江西省油茶种质资源保护与利用实验室,江西 南昌 330013）

WOX 基因家族是植物特有的转录因子，参与调节干细胞维持、胚胎发育、侧生器官发育、器官再生等生物学过程，拟南芥（Arabidopsis thaliana）、黄瓜（Cucumis sativus）、水稻（Oryza sativa）分别含有15、11、12 个WOX 基因[1-2]。WUSCHEL（WUS）是WOX 基因家族中与作物产量相关的重要成员，在顶端分生组织中表达，参与干细胞的维持，WUS 功能缺失突变体wus-1只有1 个雄蕊，没有心皮[3]；黄瓜中过表达CsWUS可以增加心皮数[4]；番茄（Solanum lycopersicum）QTL位点lc 位于SlWUS 基因下游1080 bp 后区域，该区域的2 个SNP 与心皮数的变化相关，从而使番茄心皮数增加，果实变大[5]；此外，WOX4、WOX5、WOX9 也参与干细胞的维持[6-9]。WOX 基因家族可以分为3 个分支：古分支（包括WOX10、WOX13、WOX14）、中间分支（包括WOX8、WOX9、WOX11、WOX12）、WUS分支（包括WUS、WOX1、WOX2、WOX3、WOX4、WOX5、WOX6、WOX7）[10-12]。普通油茶（Camellia oleifera）是我国第一大木本油料作物，一般所指的油茶为普通油茶，目前对油茶WOX 转录因子缺乏了解，该研究通过对油茶基因组、转录组数据的挖掘，鉴别出18个WOX 基因，并进一步分析了其表达的组织特异性，为深入研究该家族基因的生物学功能提供了参考。

1 材料与方法

1.1 数据来源

油茶（CON）基因组WOX 基因家族的蛋白质序列及CDS序列来自GitHub（https://github.com/Hengfu-Yin/CON_genome_data）；拟南芥WOX 基因家族的蛋白质序列来自Phytozome（https://jgi.doe.gov/data-and-tools/phytozome/）；SlWUS 及水稻WOX 基因家族的蛋白质序列来自NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）；油茶花芽（CRR274890、CRR274891、CRR274892）、雄蕊（CRR274872、CRR274873、CRR274874）的转录组数据来自GWH（https://ngdc.cncb.ac.cn/gwh/），叶（SRR5061852、SRR5061853 、SRR5061854）、根（SRR8698748 、SRR8698749、SRR8698750）、 种 仁（SRR10428065、SRR10428066、SRR10428067）、柱头（SRR8275897、SRR8275898、SRR8275899） 的 转 录 组 数 据 来 自NCBI。

1.2 油茶WUS 的鉴定

利用BLAST 软件，以拟南芥的WUS 蛋白质序列搜索油茶良种赣无1 花蕾转录组CDS数据库[13]，得到同源基因的部分CDS 序列及其蛋白质序列，用Boetie2[14]软件将转录组测序数据单读段比对到CDS序列，根据读段编号用自编的Perl 脚本提取成对的读段，在默认状态下用Cap3 软件[15]进行序列拼接，获得同源基因的mRNA 序列；再用Boetie2 软件将转录组测序数据单读段比对到mRNA 序列，提取成对的读段，用Cap3 软件进行序列拼接，获得新的mRNA序列；重复上述过程，直到mRNA 序列不再延伸。用油茶WUS 同源基因的mRNA 序列搜索油茶良种赣无1 基因组三代测序数据[16]，得到含有油茶WUS 同源基因mRNA 序列的亚读段；亚读段经过校正后，用Augustus[17]软件进行基因预测，得到油茶WUSCHEL同源基因的全长CDS 序列。

1.3 系统进化树构建

利用MEGA7[18]软件对油茶、拟南芥、黄瓜、水稻等植物WOX 基因家族的蛋白质序列进行比对，构建WOX 基因家族蛋白质系统进化树(Neighbor-joining法)。

1.4 油茶WOX 基因的表达分析

利用Boetie2[14]软件将油茶花芽、雄蕊、柱头、叶、根、种仁等6 种组织（或器官）样品的转录组数据单读段比对到油茶WOX 基因CDS 序列，统计匹配的读段数，计算基因表达水平RPKM（109×匹配读段数/读段总数/基因长度）。

2 结果与分析

2.1 油茶WOX 基因家族的鉴定

以拟南芥15 个WOX 基因的蛋白序列为query，利用BLAST 软件在油茶（CON）全基因组蛋白质序列中鉴定出17 个WOX 基因家族同源体（表1），但未得到WUS 的同源基因。

以WUS 序列搜索油茶花蕾转录组CDS 数据库，得到1 条最佳匹配序列，经过序列比对，该条序列为WUS 的同源基因，将转录组测序数据单读段比对到油茶WUS 的同源基因序列，提取成对读段，用Cap3软件进行序列拼接，获得油茶WUS 同源基因的mRNA 序列；用油茶WUS 同源基因的mRNA 序列分别搜索油茶基因组三代测序数据，得到1 条亚读段，亚读段经过校正后，长度为30936 bp（GenBank 登录号：MW512817），用Augustus 软件进行基因预测，得到油茶WUSCHEL 同源基因的全长mRNA 序列、全长CDS 序列及aa 序列，其结果与转录组测序数据的拼接结果基本一致，将油茶WUS 同源基因命名为CoWUS（GenBank 登录号：MW512818）。

2.2 WOX 基因家族蛋白质序列进化分析

用WOX 基因家族的45 条蛋白质序列构建进化树（表1、图1），结果表明，油茶的18 个WOX 基因可以分为3 个分支。CoWUS、CoWOX1A、CoWOX1B、CoWOX1C、CoWOX1D、CoWOX2A、CoWOX2B、CoWOX3A、CoWOX3B、CoWOX4A、CoWOX4B、CoWOX4C、CoWOX7等13 个基因属于WUS 分支，CoWOX9A 与CoWOX9B属于中间分支，CoWOX11A、CoWOX11B、CoWOX13等3 个基因属于古分支。在WUS 分支中，CoWUS 和WUS、SlWUS、OsWOX1 在一个亚支，是WUS 的同源基因，可能参与油茶心皮数的调控。

图1 WOX 基因家族蛋白质的系统进化树Fig. 1 Neighbor-joining phylogenetic tree of WOX gene family proteins

表1 系统进化树中WOX 基因家族蛋白质及其编号Tab. 1 Proteins from WOX gene family in phylogenetic tree and their accession numbers

2.3 油茶WOX 基因家族的表达谱

用来自油茶花芽、雄蕊、柱头、叶、根、种仁等6 种组织（或器官）样品的转录组数据对18 个WOX 基因进行表达分析（表2），结果表明：CoWOX1A 与CoWOX1B 的表达谱比较相似，但CoWOX1B 在柱头的表达与CoWOX1A 存在较大差异；CoWOX1C 与CoWOX1D 的表达谱基本一致，在柱头的表达水平最高；CoWOX2A 与CoWOX2B 的表达谱完全一致，在根的表达水平最高，具有较高的组织特异性；CoWOX3A与CoWOX3B 的表达谱基本一致，主要在花芽、雄蕊中表达，具有较高的组织特异性，CoWOX3A 的表达水平高于WOX3B；CoWOX4A 的表达没有组织特异性，表达水平最高的样品是根；CoWOX4B 与CoWOX4C 的表达谱基本一致，没有组织特异性，表达水平最高的样品是根，最低的是叶片；CoWOX11A与CoWOX11B 的表达谱基本一致，在种仁中表达水平最高，也是18 个WOX 基因中表达水平最高的；CoWOX7、CoWOX9A、CoWOX9B、CoWOX13 的表达没有组织特异性，CoWOX9A 与CoWOX9B 的表达谱基本一致；CoWUS 的表达没有组织特异性，表达水平最高的样品是柱头，其次是花芽，最低的是叶片和根。

表2 油茶WOX 基因家族的表达谱Tab. 2 Expression pattern of WOXs in Camellia oleifera

3 结论与讨论

该研究从油茶基因组中鉴别出18 个WOX 基因，基因表达分析结果表明这些基因可能参与不同的生物学过程；CoWOX11A 与CoWOX11B 在种仁中高水平表达，可能对种仁发育具有重要作用；果实心皮数与茎尖CLV-WUS 干细胞信号转导途径有关[19-22]，蛋白质序列进化分析表明，CoWUS 是WUS 的同源基因，在分析的6 种组织（或器官）样品中，CoWUS 表达水平最高的样品是柱头，表明CoWUS 可能参与油茶心皮数的调控；未来将围绕CoWUS 开发SSR、SNP 分子标记，对油茶种质资源群体进行心皮数的关联分析，发现可以增加心皮数的等位基因，为超多心皮、超大果型、超高产普通油茶良种的选育奠定理论与种质基础。