高效液相色谱法测定温郁金药材醋制前后5 种成分含量*

乔溪莹，瓮学智

（1.北京中医药大学附属护国寺中医医院，北京 100035； 2.北京市丰台区食品药品安全监控中心，北京 100071）

温郁金为姜科植物温郁金Curcuma wenyujinY.H.Chen et C.Ling的干燥块根，具有活血止痛、行气解郁功效，是中医治疗痛经、乳房胀痛、胸腹刺痛的常用药物［1］。温郁金药材中含有莪术烯醇、莪术二酮、莪术醇、吉马酮、β−榄香烯等活性成分，可通过醋制、酒制等加工提纯方式制成多种成品［2］。醋制是常用的加工炮制方式，会影响中药成分含量［3］。目前，针对温郁金药材醋制前后有效成分含量的变化仍有争议。因此，本研究中探讨了温郁金药材醋制前后莪术烯醇、莪术二酮、莪术醇、吉马酮、β−榄香烯5 种有效成分含量的变化情况，旨在明确该炮制方式对温郁金药材有效活性成分的影响，为后续温郁金药材的加工炮制及临床应用提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC −20AT 型高效液相色谱仪（日本Shimadzu 公司）；CP225D型分析天平（德国Sartorius公司，精度为十万分之一）；KQ −250E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；FW100型万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；Millipore超纯水处理系统（美国Millipore公司）。

1.2 试药

莪术二酮对照品（批号为111800 −201302，含量99.8%），莪术醇对照品（批号为100185 −201908，含量99.9%），吉马酮对照品（批号为111665 −201906，含量99.8%），β−榄香烯对照品（批号为100268 −201903，含量99.4%），均购自中国食品药品检定研究院；莪术烯醇对照品（上海源叶生物科技有限公司，批号为R21M9F61833，含量≥98%）；甲醇、乙腈均为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。温郁金药材样品，2020 年2 月采集于浙江省温州市的温郁金种植示范基地，由北京市药品检定研究院中药饮片检验员杜小伟鉴定为正品。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Waters Sunfire −C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）−0.5%冰醋酸水溶液（B），梯度 洗 脱（0～13 min 时42%A，13～20 min 时42%A→50%A，20～40 min 时50%A→80%A，40～42 min 时80%A→90%A）；流速：1.0 mL/min；检测波长：214 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

2.2 溶液制备

取莪术烯醇、莪术二酮、莪术醇、吉马酮、β−榄香烯对照品各10 mg，精密称定，置5 mL棕色容量瓶中，加甲醇充分溶解并定容，得质量浓度分别为1.061，1.023，1.016，1.007，1.035 mg/mL 的单一对照品贮备液；分别吸取适量置10 mL棕色容量瓶中，加甲醇定容，按2 倍稀释法稀释，获得对应的对照品溶液，加甲醇定容即得混合对照品溶液。取药材样品适量，制备温郁金生片，以5∶1（m/V）比例混合温郁金生片与米醋，密封2 h后蒸15 h，取出晾干并研磨成粉，取1 g（过40目筛），精密称定，加入甲醇20 mL，密塞称定质量，超声（功率200 W，频率50 kHz）处理40 min，放冷，再次称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.3 方法学考察

1.莪术烯醇 2.莪术二酮 3.莪术醇 4.吉马酮 5.β −榄香烯A.混合对照品溶液 B.供试品溶液图1 高效液相色谱图1.Curcumenol 2.Curdione 3.Curcumol 4.Germacrone 5.β −elemeneA.Mixed reference solution B.Test solutionFig.1 HPLC chromatograms

系统适用性试验：精密吸取2.2项下混合对照品溶液、供试品溶液各10 μL，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录色谱图。供试品溶液色谱中，在与混合对照品溶液色谱相应位置有吸收峰，且分离度均大于1.5，基线分离良好；理论板数按莪术烯醇峰计应大于3 000。详见图1。

线性关系考察：取2.2 项下混合对照品溶液适量，加甲醇稀释，得莪术烯醇质量浓度分别为31.830，15.915，7.957，3.979，1.989 μg/ mL，莪术二酮质量浓度分别为204.60，102.30，51.15，25.58，12.79 μg/mL，莪术醇质量浓度分别为30.480，15.240，7.620，3.810，1.905 μg/ mL，吉马酮质量浓度分别为100.700，50.350，25.180，12.590，6.294 μg/mL，β−榄香烯质量浓度分别为103.500，51.750，25.880，12.940，6.469 μg/mL的系列混合对照品溶液。取适量，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以待测成分进样量（X，μg）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程。结果见表1。

精密度试验：取醋制后饮片样品，按2.2项下方法制备供试品溶液，再按2.1项下色谱条件进样测定，平行测定6次，记录峰面积。结果见表1，表明方法精密度良好。

稳定性试验：取2.2项下供试品溶液，室温下放置0，2，4，8，16，24 h时，按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果见表1，表明供试品溶液室温放置24 h内稳定。

表1 线性关系考察及精密度、稳定性、重复性试验结果Tab.1 Results of the linear relation，precision，stability and repeatability tests

重复性试验：取醋制后饮片样品，按2.2 项下方法平行制备6 份供试品溶液，再按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算含量。结果见表1，表明方法重复性良好。

加样回收试验：取醋制后饮片样品共6 份，每份0.5 g，精密称定，分别精密加入一定质量浓度的混合对照品溶液，再定容至20 mL，按2.2项下方法制备供试品溶液，再按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率。结果见表2。

表2 加样回收试验结果（n=6）Tab.2 Results of the recovery test（n=6）

2.4 样品含量测定

取醋制前后的样品粉末各1 g，分别按2.2 项下方法平行制备3 份供试品溶液，再按2.1 项下色谱条件进样测定，记录色谱图，结果见表3。可见，醋制后的饮片样品中莪术烯醇、莪术二酮、莪术醇、吉马酮、β−榄香烯的含量均较醋制前低。

表3 温郁金药材醋制前后的5种成分含量变化（±s，μg/g，n=3）Tab.3 Content changes of five components in Curcuma wenyujin before and after processing with vinegar（±s，μg/g，n=3）

表3 温郁金药材醋制前后的5种成分含量变化（±s，μg/g，n=3）Tab.3 Content changes of five components in Curcuma wenyujin before and after processing with vinegar（±s，μg/g，n=3）

时间醋制前醋制后莪术烯醇0.055 1±0.000 7 0.045 8±0.001 1莪术二酮2.077 0±0.012 1.995 0±0.014莪术醇0.092 8±0.001 8 0.084 1±0.002 2吉马酮0.615 4±0.001 4 0.586 0±0.002 1 β −榄香烯0.433 1±0.002 1 0.405 7±0.001 5

3 讨论

莪术烯醇、莪术二酮、莪术醇、吉马酮、β−榄香烯是温郁金中的主要有效成分，均为倍半萜类化合物，主要分布于挥发油成分中并可以发挥抗肿瘤、抗血栓、抗炎功效，5 种成分分离度均大于1.5，且5 种有效成分进样量与峰面积间均存在良好的线性关系。因此，本研究中选此5 种成分为温郁金药材醋制前后成分变化的检测指标。

吉马酮、莪术醇等具有1，5 −二烯结构化合物若采用常用的气相色谱法、气相色谱−质谱联用法检测，在色谱柱高温条件下会造成挥发油活性成分重排、转化并产生数据偏差，影响数据的真实性与可参考价值［4］。HPLC 法是检测有效成分的常用技术之一，具有准确度高、检测速度快等多项优势［5］。本研究结果显示，采用HPLC法检测温郁金饮片中5种有效成分，其精密度、稳定性及重复性均较好，且具有较高的适用性。因此，本研究中选用HPLC 法检测温郁金药材/ 饮片有效活性成分的变化情况。

酯类物质是醋中的主要成分，酯类、醇类物质在醋制加热条件下与温郁金药材/饮片中的活性成分相互作用，进而导致温郁金中成分含量的升高或降低［6］。温郁金药材醋制前后的药效功能各有所倚重，生温郁金长于行气解郁、清心凉血，醋制后主入肝经，尤善于散瘀止痛。本研究中醋制后温郁金饮片的莪术烯醇、莪术二酮、莪术醇、吉马酮、β−榄香烯含量均降低，其中莪术二酮降低最显著。童黄锦［7］的研究表明，温郁金药材醋制后能增强其对血小板聚集、疼痛因子、改善血液循环等药效学指标的调节控制作用。温郁金药材醋制前后β−榄香烯、吉马酮等成分含量减少而其疗效反而增强，其原因为中药炮制加工及辅料会影响各成分在体内的转化过程，进而导致药效学存在差异，因此温郁金药材醋制后可增强散瘀止痛疗效［8−10］。但本研究的结果与部分文献结果存在一定差异，其原因可能是选取的温郁金药材产地不同，其受到土壤养分、水质、光照等地域因素影响导致活性成分含量不同，因此醋制前后的成分变化情况存在差异，后续可针对不同产地的温郁金醋制前后成分变化情况进行深入研究。本研究中莪术烯醇、莪术二酮、莪术醇、吉马酮、β−榄香烯含量降低，可能是由于加工工艺不完善，导致有效成分流失，后续应将温郁金药材醋制工艺优化作为重点发展方向之一。

综上所述，本研究中建立的检测温郁金药材醋制加工前后莪术二酮、莪术醇、莪术烯醇、吉马酮、β−榄香烯含量变化的HPLC 法，具有检测速度快、重复性良好和稳定性高等优势，可对温郁金药材醋制加工进行质量控制。醋制是提升温郁金饮片有效成分的良好方案，可作为温郁金药材产地规范化加工发展的参考方向，但应进一步优化此工艺，同时避免加工过程中温郁金饮片有效成分的流失。