银翘散对鼻黏膜屏障功能低下模型小鼠的影响*

杨居崩，李 爽，聂发龙，赵显芳，朱紫陌，代 蓉，李秀芳

（云南中医药大学中药学院，云南 昆明 650500）

上呼吸道感染（URTI）是外鼻孔至环状软骨下缘包括鼻、咽或喉部急性炎症的总称，常由病毒和细菌相互作用引起，包括普通感冒、流行性感冒、病毒性咽炎等［1−2］。由于引起URTI 的病原微生物绝大部分经口鼻进入机体，因此鼻黏膜屏障对于防御病原体进入机体至关重要。该屏障由机械屏障、化学屏障、微生物屏障和免疫屏障有机地结合在一起，共同阻止病原微生物对机体的侵袭［3］。鼻黏膜免疫功能低下是URTI 发生的重要原因，也与URTI反复发作密切相关［4−5］。银翘散源于清代医家吴鞠通《温病条辨》，被称为“辛凉平剂”，临床常用于治疗普通感冒、流行性感冒、急性支气管炎等疾病，疗效良好。课题组前期研究发现，银翘散可通过增强上呼吸道免疫屏障功能发挥预防及改善URTI 的作用［6−8］，本研究中探讨了银翘散对模型小鼠鼻黏膜屏障功能低下的影响。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器、试药与动物

仪器：Infinite M200 PRO型酶标仪（瑞士Tecan公司）；EPS −301型垂直电泳仪、Mini Trans −Blot®Cell型湿转仪，均购自美国Bio −Rad 公司；UVP凝胶成像分析系统（美国Bio Spectrum 公司）；XS125A 型分析天平（瑞士Precisa公司）。

试药：BCA 蛋白浓度检测试剂盒（批号为090321211027）、RIPA 裂解液（批号为20211104）、过硫酸铵（APS）（批号为ST005）、TEMED（批号为ST728），均购自上海碧云天生物技术有限公司；吐温−20（德国Biofroxx 公司，批号为EZ6789B150）；10%十二烷基硫酸钠（SDS，批号为G522KA5701）、二硫苏糖醇（DTT，批号为A620058 −0025），均购自生工生物工程（上海）股份有限公司；Tris（批号为1109U071）、1 mol/L Tris −HCl缓冲液（批号为20191217）、1.5 mol/ L Tris −HCl 缓冲液（批号为20211230）、甘氨酸（批号为1210J061），均购自北京索莱宝科技有限公司；免疫球蛋白A抗体（Anti −IgA，美国Novus Biologicals 公司，批号为NB7501）；Rabbit Anti −Goat IgG（H+L）（批号为20000332）、Goat Anti −Rabbit IgG（H + L）（批号为20000373）、β −Actin Mouse McAb（批号为10021787）、紧密连接蛋白（Occludin）Rabbit PolyAb（批号为13409 −1 −AP），均购自美国Proteintech 公司；脂多糖（LPS，批号为068M4093V）、异硫氰酸荧光素（FITC）−葡聚糖（批号为CBW4630），均购自美国Sigma公司；水为去离子水。

饮片：金银花（批号为C180301）、连翘（批号为C180601）、桔梗（批号为C181001）、竹叶（批号为C190201）、生甘草（批号为C180501）、淡豆豉（批号为C190401）、牛蒡子（批号为C180801）、苇根（批号为C180901）、薄荷（批号为C181204）、荆芥穗（批号为C190701），均购自云南慈慧药业有限公司。

动物：SPF级雄性KM小鼠，5周龄，体质量18～20 g，购自成都达硕实验动物有限公司，实验动物生产许可证号SCXK（川）2020 −030，饲养于云南中医药大学动物实验室［SYXK（滇）K2017 −0005］，饲养期间小鼠自由饮水，饲喂普通维持饲料。饲养环境：昼夜各半、循环照明，湿度恒定，温度为22～25 ℃。所有操作均符合云南中医药大学实验动物伦理学要求（审批号R −06202009）。

1.2 方法

1.2.1 药液制备

除薄荷和荆芥穗外，取其余药材饮片，加入12倍量的水，浸泡30 min，煎煮10 min，再将薄荷和荆芥穗倒入共煎5 min，滤过，取续滤液，45 ℃下旋蒸至所需浓度。4 ℃保存，使用时以温水预热，1周内使用［9］。

1.2.2 LPS 单次滴鼻刺激实验

分组与建模：将40只小鼠分为正常对照组（8只）和模型A 组（32 只）。模型A 组小鼠以LPS（2 mg/ kg，每20 g 体质量20 μL，每侧鼻腔各10 μL）单次滴鼻，正常对照组小鼠滴鼻等体积磷酸盐缓冲液（PBS）。

IgA 及Occludin 蛋白表达：采用Western blot 法。模型A 组滴鼻结束后1，3，5，7 d 时各取8 只小鼠，过量麻醉处死，剥取小鼠鼻黏膜，剪碎，加入1 mL RIPA 裂解液，冰上匀浆，14 000 r /min离心5 min，取上清，以BCA法检测蛋白浓度。SDS −PAGE电泳，电转，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，清洗3次，加入一抗，4 ℃孵育过夜，清洗3次，加入二抗，室温振摇孵育1 h，清洗3次，加入ECL 化学发光试剂，显影、成像。将条带灰度值数字化，目的条带与内参条带灰度比值为各目的蛋白相对表达量。

1.2.3 LPS 连续滴鼻刺激实验

分组与建模：将40只小鼠分为正常对照组（8只）和模型B 组（32 只）。滴鼻剂量同1.2.2 项。模型B 组各取8 只小鼠分别连续1，3，5，7 d 滴鼻给药，每天1 次，均于末次滴鼻前1 h以FITC −葡聚糖滴鼻。正常对照组小鼠滴鼻等体积PBS。

IgA及Occludin蛋白表达：末次给药后处死小鼠，剥取鼻黏膜，按1.2.2 项下Western blot 法测定蛋白相对表达量。

鼻黏膜上皮屏障通透性：采用酶标仪测定小鼠血清葡聚糖水平，以评估小鼠鼻黏膜上皮屏障通透性，水平越高表明通透性越好。

1.2.4 银翘散对模型小鼠的影响

分组与建模：将32只小鼠分为正常对照组（等体积蒸馏水）、模型C组（等体积蒸馏水），以及银翘散低、高剂量组（相当于生药24.18 g/kg 和72.54 g/kg），各8 只。除正常对照组外（等体积PBS 滴鼻），其余组小鼠以LPS（剂量同1.2.2项）滴鼻后6 h灌胃相应药物（0.2 mL/10 g）或等体积蒸馏水，每天1次，连续7 d。

IgA及Occludin蛋白表达：末次给药后处死小鼠，剥取鼻黏膜，按1.2.2 项下Western blot 法测定蛋白相对表达量。按1.2.3项下方法评估小鼠鼻黏膜上皮屏障通透性。

1.3 统计学处理

采用SPSS 26.0 统计学软件分析。计量资料以±s表示。资料符合正态分布且各组方差齐，两组间比较行t检验，两组以上行单因素方差分析，两两比较行LSD−t检验；资料符合正态分布但各组方差不齐，或资料不符合正态分布且各组方差不齐，行Kruskal −Wallis非参数检验，两两比较，采用Bonferroni 法校正P值。P＜0.05 为差异有统计学意义。采用GraphPad Prism 9.0软件作图。

2 结果

2.1 LPS 单次滴鼻后小鼠鼻黏膜组织中IgA 及Occludin 蛋白表达水平

与正常对照组比较，模型A 组小鼠鼻黏膜组织中IgA 蛋白表达水平仅在滴鼻后1 d 时显著降低（P＜0.01），3，5，7 d时持续升高且3 d时基本恢复正常；Occludin蛋白表达水平仅在3 d时显著降低（P＜0.01）。详见图1。

2.2 LPS 连续滴鼻后小鼠鼻黏膜组织中IgA及Occludin 蛋白表达、鼻黏膜上皮屏障通透性

A1，B1.电泳图 A2，B2.统计数据A.IgA B.Occludin注：与正常对照组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01。图2同。图1 LPS单次滴鼻后小鼠鼻黏膜组织中IgA，Occludin蛋白表达水平A1，B1.Electrophoretogram A2，B2.Statistical dataA.IgA B.OccludinNote：Compared with those in the normal control group，*P ＜0.05，**P ＜0.01（for Fig.1 −2）.Fig.1 Expression levels of IgA and Occludin protein in nasal mucosa of mice after single nasal drip of LPS

与正常对照组比较，模型B 组予LPS 滴鼻1 次（1 d 1 次，下同）和连续滴鼻3 次时，小鼠鼻黏膜组织中IgA蛋白表达水平显著降低（P＜0.01），连续滴鼻5，7次时，IgA 蛋白表达水平虽持续升高，但未恢复至正常水平；Occludin 蛋白表达水平在连续滴鼻3 次时显著降低（P＜0.01）。与正常对照组比较，模型B 组连续滴鼻3，5，7次后，小鼠血清葡聚糖水平显著升高（P＜0.05）。详见图2。

2.3 银翘散对模型小鼠相关指标的影响

与正常对照组比较，模型C 组小鼠鼻黏膜组织中Occludin 蛋白表达水平显著降低（P＜0.01），血清葡聚糖水平显著升高（P＜0.01）；与模型C 组比较，银翘散低、高剂量组小鼠鼻黏膜组织中Occludin蛋白表达水平显著升高（P＜0.05），血清葡聚糖水平显著降低（P＜0.01）；银翘散高剂量组小鼠鼻黏膜组织中IgA 蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）。详见图3。

A1，B1.电泳图 A2，B2.统计数据A.IgA B.Occludin C.葡聚糖注：与正常对照组比较，△△P ＜0.01；与模型C组比较，#P ＜0.05，##P ＜0.01。图3 银翘散对模型小鼠相关指标的影响（±s，n=10）A1，B1.Electrophoretogram A2，B2.Statistical dataA.IgA B.Occludin C.DextranNote：Compared with those in the normal control group，△△P ＜0.01；Compared with those in the model group C，#P ＜0.05，##P ＜0.01.Fig.3 Effect of Yinqiao Powder on relevant indexes of model mice

3 讨论

鼻黏膜屏障功能低下是URTI 发病的重要原因，气管炎、支气管炎、肺炎等严重的下呼吸道感染也常始于URTI［10−11］，故保持鼻黏膜屏障功能的完整性对于防治URTI 具有重要意义。有研究表明，IgA 有助于预防流感，鼻腔或血清中IgA含量较高的H1N1流感患者，恢复时间更短［12−13］。Occludin 蛋白是首个完整的形成紧密连接的跨膜蛋白［14−15］，在维持上皮细胞紧密连接屏障中起关键作用，Occludin 蛋白缺失将导致大分子的选择通透性增加［16］。本研究结果表明，以LPS 分别单次滴鼻后第1 天和第3 天，小鼠鼻黏膜组织中IgA 和Occludin蛋白表达水平明显降低，随后开始升高至接近正常水平，说明LPS 单次刺激诱导的炎症较轻，免疫屏障和机械屏障破坏程度轻，容易恢复至正常水平。LPS 连续滴鼻诱导持续炎症刺激，滴鼻1 次和连续3 次时，小鼠鼻黏膜组织中IgA 蛋白表达水平明显降低，Occludin 蛋白表达水平在连续滴鼻3，5，7 次时明显降低，血清中FITC −葡聚糖水平升高，即鼻黏膜上皮屏障的通透性升高，说明持续的炎症刺激可降低鼻黏膜免疫屏障、机械屏障的功能，这为病原微生物的入侵提供了便利。

银翘散是治疗URTI 的代表方，具有辛凉透表、清热解毒的功效，用于温病初起、邪犯肺卫证。方中以金银花、连翘为君药，可疏散风热、清热解毒；薄荷、牛蒡子可辛凉解表、清利咽喉，桔梗可开宣肺气、止咳利咽，芦根、竹叶可清热生津，同为佐药；生甘草既可调和药性、护胃安中，又合桔梗清利咽喉，为佐使。现代药理学研究表明，银翘散具有一定的解热［17］、镇痛［18］、抗炎［19］、抗病毒［20］的作用。课题组前期研究表明，银翘散可明显降低寒冷刺激后模型大鼠血清中炎性因子水平，并能提高鼻黏膜局部免疫防御能力［21］。本研究结果表明，与模型C组比较，银翘散低、高剂量组小鼠鼻黏膜组织中IgA、Occludin蛋白表达水平明显升高，鼻黏膜上皮屏障通透性明显降低。

综上所述，银翘散可改善模型小鼠鼻黏膜免疫屏障功能，机制可能为促进鼻黏膜中Occludin 蛋白表达，降低鼻黏膜上皮屏障的通透性，从而提高鼻黏膜机械屏障功能。还可通过促进IgA 的表达，提高鼻黏膜免屏障功能。