改良孢子弹射法分离茶饼病病原菌

刘垚果，陈瑶，刘惠芳，陈薇，雷志伟，马驰宇，杨文*

1.贵州大学茶学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州省农业科学院茶叶研究所，贵州 贵阳 550006

茶饼病系低温高湿型茶树病害之一，坏损外担菌属真菌（Exobasidium vexans） 是其致病菌[1-3]。该病原菌的菌丝体潜伏于病叶的活组织中越冬和越夏，在均温15～32 °C 和相对湿度高于80%的气候条件下，病斑表面形成白色粉状物，即由担孢子组成的子实层，成为发病的行多次再侵染初次侵染源。担孢子成熟后随雨雾侵入新梢嫩叶出现新病斑，导致病害的流行[4-6]。近年来，茶饼病的季节流行性暴发，对我国茶产业造成了严重的损失，其主要为害茶树嫩叶、新梢，严重影响茶叶产量和品质，严重的减产高达90%[7-12]。为了更好地防治茶饼病，需开展其室内生测、病原菌与茶树互作、相关分子研究等，但其基础是分离纯化出可长期培养和保存的茶饼病病菌。

茶饼病的致病菌E.vexans由Massee[13]于1898年首次报道，Gadd等[14]于1948年首次确认E.vexans只产生担孢子，而并非于1898年Massee所述的分生孢子，同时明确此菌是通过角质层而非气孔进入茶树叶片体内。1950年，Gadd 等[15]认为E.vexans是专性寄生菌，不能被离体培养；但1952年Graafland[16]的研究结果证明此菌可在麦芽糖琼脂上培养；此后，Ezuka[17]于1955报道此菌可在PSA培养基上培养。由于E.vexans在培养基上生长速度慢，在分离纯化的过程中容易被其他生长快的杂菌覆盖，导致分离难度增大，属难于分离培养的病原物，所以选择此菌适宜的培养基和分离方法以提高其分离效率至关重要。Chaliha 等[18]获得了适宜E. vexans生长的3 种最优培养基及其配方，分别为PDA 培养基、查氏（Czapek dox）培养基和V8 Juice 培养基。虽然已有谭荣荣等[2]报道了E.vexans的分离方法，但在实际应用中，分离纯化菌株的机率仍然较低。

为了提高茶饼病病菌分离纯化菌株的机率，本文对比了组织分离法和孢子弹射法对E.vexans的分离率，并在孢子弹射法的基础上进行了改良；同时采用形态学观察和ⅠTS（Ⅰnternal transcribed spacer）单基因序列构建系统发育树，对改良孢子弹射法分离的菌株cbb进行了鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料

茶饼病病叶采自湄潭县黔湄601 品种茶园。茶叶提取物（99%，HPLC）购买于合肥药谷生物科技有限公司。

1.2 病原菌的分离方法

1.2.1 PDA培养基

参照Chaliha 等[18]的方法，在1 L 超纯水中加入200 g 土豆熬煮后过滤，在滤液中加入3 g 葡萄糖、30%茶叶提取物和0.4 g CaCO3，使用0.1 mol NaOH把pH调到6.5，加入15 g琼脂加热溶解，待完全溶解后，再加水至1 L。

1.2.2 不同分离方法

（1）组织分离法：把茶树病叶的病健交界处用剪刀取长约0.5 cm的组织块，放入培养皿进行表面消毒（无菌水冲洗2～3 次，75%酒精浸泡1 min，无菌水冲洗2～3 次，超净工作台自然风干），风干后接种到PDA 培养基上，25 ℃黑暗恒温培养2～3 d 后，将长出的菌丝转接到新鲜的PDA 培养基上纯化。

（2）孢子弹射法[2]：采摘病菌子实层处于生长旺盛期的病叶，无菌条件下，将双面胶贴在培养皿皿盖内壁，用解剖刀切下小块病块粘到双面胶上（子实层一面朝下），每隔1 h 观察平板上是否出现肉眼可见的1层薄薄的油状薄膜。一旦出现记录其弹射时间，并更换无菌皿盖继续培养1～2 d，等肉眼略微可见的菌落长出，挑取少量菌丝置于新的培养基上培养，并观察菌落培养性状，与Chaliha 等[18]文献报道E.vexans培养性状不同的判定为杂菌，培养14 d 后，挑取无污染菌落的菌丝续代培养3 次后，性状保持不变且孢子形态与Chaliha 等[18]报道的E. vexans一致的为纯病原物，按以下公式计算其分离纯化效率。

分离纯化效率=分离出纯病原物病叶数/分离病叶总数×100% （1）

（3）改良孢子弹射法：采摘病菌子实层处于生长旺盛期的病叶，保持叶片的完整性，保留叶柄，用无菌脱脂棉对叶片的叶柄处保湿，将双面胶贴在培养皿皿盖内壁，把处理好的叶片粘到皿盖上（子实层一面朝下），每隔1 h 观察平板上是否出现肉眼可见的1 层薄薄的油状薄膜。记录其弹射时间，并换无菌盖子继续培养1～2 d，待肉眼略微可见的菌落长出，挑取少量菌丝置于新的培养基上培养，并观察菌落培养性状，与Chaliha等[18]报道的E. vexans培养性状不同的判定为杂菌，培养14 d 后，挑取无污染菌落的菌丝续代培养3 次后，性状保持不变且孢子形态与Chaliha等[18]报道的E.vexans一致的为纯病原物，按公式（1）计算其分离纯化效率。

本次实验对采摘不同天数的病叶进行分离并单独统计其分离纯化效率，每次分离病叶的基数为30片，并重复3次。

1.3 病原菌鉴定

1.3.1 形态学观察

将病原菌接种在PDA 平板上25°C 培养30 d，观察菌落形态、颜色和生长速率。在显微镜（BX-53）下观察菌丝、孢子形态。

要杜绝“过得去”的思想。一定要切实提高质量意识，严格质量管理程序，层层负责，层层把关。每一个检修项目都要逐个认真检修确认，对质量不达标的限期整改，对造成损失的严肃处理，坚决克服只顾眼前、不顾今后，“嘴巴上严格，行动上软塌”的不良倾向。

1.3.2 分子鉴定

采用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒提取病原菌基因组DNA，并以所提基因组DNA为模板，利用引物ⅠTS5/ⅠTS4对菌株基因组DNA的ⅠTS基因进行PCR 扩增。反应体系（25 μL）：Taq DNA Master Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，上下游引物和DNA模板各1 μL。PCR反应条件：95 ℃预变 性5 min；94 ℃变 性30 s，57 ℃退 火30 s，72 ℃延伸90 s，30 个循环；72 °C 延伸10 min，4 ℃保存。PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测质量后，送上海生工有限公司测序。

将PCR 产物测序结果经NCBⅠ中BLAST 比对后，选取序列相似性高的菌株，利用BioEdit对测序序列和下载自NCBⅠ-Gen Bank 的序列进行多位点序列比对，对其进行手动校正，并将序列采用RA×ML构建系统进化树。

nrDNA-ⅠTS片断扩增/测序所用引物：

ⅠTS5 5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'

ⅠTS4 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'

1.4 病原菌致病性测定

将分离纯化的病原菌放入25 ℃培养箱中培养14 d，长出孢子后，在其培养皿中加入适量含有0.05%吐温-80的无菌水，用无菌手术刀将孢子刮下，经无菌纱布过滤后配成含孢子1.0×105个/mL的悬浮液。采摘黔湄601 离体茶树枝，经无菌水冲洗干净后，置于锥形瓶中，在枝条下面加入无菌水保持其活性。采用喷雾法接种孢子悬液，接种后用加湿器每间隔4 h 保湿2 h，保持相对湿度90%以上，温度18～22 ℃，无菌水接种为对照。定时观察病情,记录发病叶片数量。病情稳定后测定一次病斑直径。每次接种100 枝黔湄601 茶树枝，重复3次。

1.5 数据分析

采用SPSS22软件对数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同分离方法的分离纯化率

如表1所示，采用传统的组织分离法，几乎分离不出孢子形态与Chaliha 等[18]报道的E.vexans一致的纯病原物，无论是采摘第几天的病叶，分离纯化效率均为0，与病叶的新鲜程度无关。对第一天至第四天采摘的病叶进行分离，传统孢子弹射法的分离纯化效率分别为52%、34%、15%和4%，改良孢子弹射法的分离纯化效率分别为78%、58%、24%和10%。相对于传统孢子弹射法，改良孢子弹射法对当天采摘的病叶的分离纯化效率可提高1.5 倍。结果表明，使用孢子弹射法和改良孢子弹射法，分离纯化效率和病叶的新鲜程度有关，病叶新鲜程度越高，分离纯化效率越高。

表1 不同分离方法的分离纯化效率 %

2.2 病原菌的形态学观察结果

选择症状典型的发病病叶（图1），采用改良孢子弹射法，分离培养并筛选出形态与Chaliha等[18]报道的E.vexans相似的菌株cbb。cbb 在PDA培养基上生长非常缓慢，培养21 d，其菌落直径为21～22 mm，平均生长速率为1.00～1.07 mm/d；菌落直径长至22 mm 左右后，生长趋于停止。该菌在PDA 培养基上菌落形态比较完整，菌丝正面色泽呈米黄色，菌丝密度较高，背面呈茶黄色（图2）。以100 倍显微镜观察发现，担孢子无色，光滑，长椭圆形至倒卵形，顶端钝圆，末端略弯曲或不弯曲，大小为（7～16）μm ×（3～5）μm（图3）。

图1 茶饼病田间症状

图2 在PDA培养基上的菌株cbb

图3 担孢子形态（×100）

2.3 分子生物学鉴定结果

PCR 扩增基因组DNA 的ⅠTS 片段，大小为544 bp（图4），经BLAST 比对后选取相似度高的菌株为内群，以登录号EU692762 Exobasidium_sp和AB180336 Exobasidium shiraianum 为外群，构建系统进化树（表2）。结果显示，菌株cbb 和登录号MG847206 的菌株聚为一支，菌株相似度达100%（图5）。

图4 PCR扩增凝胶电泳图（ⅠTS：544 bp）

图5 基于ⅠTS基因序列的单基因系统进化树

表2 用于构建系统进化树的菌名及GenBank登录号

2.4 致病性测定

分离菌株cbb的室内人工回接实验表明，接种后，最早于第七天呈现茶饼病的初期症状，叶片正面为浅黄绿色近圆形的透明斑点，叶片背面病斑不明显，病斑直径3～7 mm（图6），在之后无论怎样培养，都只表现为初期症状，没有子实层形成，不能出现田间茶饼病发病的后期症状。由于没有子实层形成，所以采用组织分离法对回接发病叶片进行分离，再次获得了该菌，将该菌再次回接到黔湄601后仍只表现出初期症状。结果表明，菌株cbb在室内对黔湄601的致病力表现较差。回接7 d 后，菌株cbb 对黔湄601 离体第一至第四张叶片的致病率分别为38%、29%、7%、3%。

图6 离体叶片回接情况

3 小结与讨论

坏损外担菌（E.vexans）虽然最早被Gadd 和Loos 认为是专性寄生菌，但Graafland 和Ezuka 相继在不同培养基上成功培养[15-17]。本文通过改良孢子弹射法分离得到1株纯病原物cbb，在继代培养了3代后，其性状依然保持不变。实验中发现，3周内该菌株在PDA 培养基上菌落直径随着时间延长而增加，超过3 周后生长趋于停止，这可能与后期营养缺乏有关。该菌在培养基上菌落形态比较完整，正面色泽呈米黄色，密度较高，背面呈茶黄色，与李继业等[19]报道的E.vexans在PDA 培养基的生长性状几乎一致。菌株cbb 的担孢子无色，光滑，长椭圆形至倒卵形，顶端钝圆，大小为（7～16）μm ×（3～5）μm。Massee[13]描述的担孢子为透明，无毛，卵形，长圆形，通常稍不等边，5 μm×3 μm；Mann[20]将它们描述为极其微小的卵形身体，成对生长在被称为担子的特殊部位的末端；Tunstall 等[21]将染色的病原菌放在显微下观察到“香肠形状”。上述关于E.vexans担孢子的描述与本研究中的担孢子观察结果相吻合。因此，形态特征和分子鉴定的结果表明，本研究分离菌株cbb为E.vexans。

Venkatekam 等[22]根据茶饼病病害循环，将其分为7个阶段：第一阶段，真菌穿透3 d以后，出现直径小于0.5 mm半透明斑点；第二阶段，斑点直径大于0.5 mm，小于1 mm；第三阶段，斑点直径大于1 mm，小于3 mm；第四阶段，斑点直径大于3 mm，小于6 mm，且斑点有明显损害；第五阶段，损害部叶片背面膨胀凸出，菌丝扩展到海绵组织的细胞间；第六阶段，孢子开始形成；第七阶段，大量孢子形成。Jayaswall 等[23]将茶饼病发生时期分为4 个阶段，第一阶段，孢子侵染后24 h 之内；第二阶段，孢子萌发阶段，孢子侵染后7 d之内；第三阶段，吸器形成阶段，孢子侵染后14 d 之内；第四阶段，孢子形成以及二次侵染，大约在孢子侵染后20 d。Nisha 等[24]将茶饼病发生时期分为4 个阶段，其中第一阶段，出现直径0.5～1.0 mm 半透明斑点；第二阶段，出现亮斑；第三阶段，孢子开始形成；第四阶段，产生孢子生殖损伤。赵晓珍等[25]将E.vexans侵染所致茶饼病分为4个阶段，第一阶段，病斑直径为3～6 mm；第二阶段，病斑处开始膨胀，形成叶片正面平滑光亮，凹陷或凸起；第三阶段，担孢子大量形成，叶背面呈纯白色天鹅绒状；第四阶段，病斑内组织细胞营养耗尽，寄主抗性反应产生，病斑组织坏死，呈褐色干枯溃疡状，病斑扩展受到限制。上述茶饼病病原菌侵染分期研究中，以Nisha等和赵晓珍等的分期较为合理。本研究的菌株cbb 回接7 d 后，感病叶片上只出现Nisha 等所述的第二阶段症状；而对照组没有发病，表明菌株cbb是致病菌。在本试验条件下后续未观察到第三至第四阶段症状，其原因之一可能是茶饼病发病需要严格的条件（湿度和温度），室内的环境达不到要求[26]；另一种原因可能是茶饼病发病的严重程度还与其他菌协同作用有关。植物病原菌间的相互协同作用可以影响某一特定植物病害的发展并导致其严重程度[27]。Barman 等[28]研究发现Pestalotiopsisspp.和Nigrosporasp.一直存在于茶饼病发病的各个阶段，推测此2 种病原菌可能在茶饼病发病过程中引起额外的发病机制，进而可能促进了茶饼病的发病和流行。

国内外对E.vexans室内的生物测试报道较少，印度Chaliha等[29]报道了交联Cu:ZnS-木质纤维素纳米复合材料对E.vexans抗菌活性的测定；韦思梅等[30]筛选出酸疮痂链霉菌（Streptomyces acidiscabies）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）对茶饼病菌具有拮抗作用。而田间的试验报道较多，如陈雪芬等[31]推荐在茶饼病初期施用75%十三吗啉乳油可以用于防治茶饼病；魏朝霞等[32]报道了99%绿颖、2%武夷霉素、10%多抗霉素和松针水提液对茶饼病均有一定的防效；冉隆珣等[33]报道了武夷菌素500～800倍范围内对茶饼病的防治效果最好。室内的生物测试实验报道较少的原因可能是E.vexans在培养基上生长缓慢，属较难分离培养的病原物，室内的分离纯化效率低，容易被生长快的杂菌所覆盖。

本文采用Chaliha等[18]优化的PDA培养基，以传统孢子弹射法为基础，对叶柄处保湿进行了优化，达到强化孢子弹射能力的目的，使培养基上油雾状孢子层形成时间由3～5 h缩短到1～2 h，降低了被其他杂菌污染的几率。通过对不同保存时间的茶饼病病叶分离纯化率进行比较，结果表明及时对茶饼病鲜叶进行分离也是该病原菌成功分离的关键之一。茶饼病的孢子在培养基上生长缓慢，使用组织分离法，病叶直接接触培养基，导致生长较快的杂菌容易抑制它的生长，很难分离出纯化的茶饼病病菌，因此建议不用组织分离法分离E.vexans。

结合本研究结果，改良孢子弹射法分离茶饼病病菌的要点如下：（1）采摘处于第三阶段症状的病叶，保持叶片的完整性，用灭菌脱脂棉对叶片的叶柄处进行保湿处理；（2）把保湿处理的完整叶片正面粘上双面胶，然后将其贴在培养皿皿盖内壁上进行弹射；（3）在弹射1～2 h 内，当平板培养基上出现肉眼可见油雾状薄膜时，立即换上无菌皿盖，并继续培养1～2 d；（4）待肉眼微见的菌落长出时，挑取少量菌丝置于新的培养基上培养；（5）培养14 d 后，选择菌落无污染的培养物，挑取少量菌丝块转移到新的培养基上进一步纯化培养。采用上述改良的孢子弹射法，可以有效分离纯化出可续代培养的E.vexans，为此菌后续的室内生物测试、致病性研究、分子生物学研究等提供纯培养物。