SPME Arrow-GC-MS鉴定3种不同杀菌乳中特征香气物质

许凌云，侯阳，杨倩，李珍，段伟，张天军，王铁龙

（1.中国检验检疫科学研究院，北京 100176；2.河北农业大学，河北 保定071000；3.中国质量认证中心，北京 100070）

0 引言

目前，国内外采用的牛乳灭菌方式主要是两种：巴氏杀菌和超高温瞬时灭菌（Ultra-high Temperature Instantaneous Sterilization,UHT）[1]。巴氏杀菌一般是在72～85℃持续杀菌15 s[2]。UHT杀菌是在135～140℃，杀菌3～4 s[3]。蒸汽浸入式杀菌技术（Infusion Technology,INF）则是将杀菌温度控制在145～158℃，杀菌时间小于1 s[4]。箭型固相微萃取（Solid-phase Microextraction Arrow,SPME Arrow）作为一项的新装置，与传统固相微萃取（Solid-phase Microextraction,SPME）纤维头相比，其机械稳定性更强，吸附灵敏度更高，吸附分析萃取速度更快。而国内外关于INF杀菌牛乳中风味物质的研究较少，因此，以SPME Arrow为基础，结合气相色谱-质谱联用，对乳源相同的巴氏杀菌乳、UHT灭菌乳和INF杀菌乳中风味物质进行检测，探究不同杀菌方法对牛乳特征香气物质的影响情况，为新的INF杀菌技术对牛乳中风味化合物的变化规律提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

由厂家提供奶源相同的巴氏杀菌全脂乳、UHT灭菌全脂乳和INF杀菌全脂乳，利用乳成分分析仪测定其蛋白质、脂肪和乳糖质量浓度，如表1所示。

表1 牛乳产品信息 g/100mL

氯化钠（分析纯）、氦气（纯度99.999%）、正构烷烃（C7～C40，色谱纯）美国o2si smart solutions公司；2-甲基-3-庚酮（色谱纯），美国sigma公司。

1.2 仪器与设备

7890B-5977A型气相色谱-质谱联用仪，美国Agilent公司；DB-WAX型毛细管柱（30 m×0.25 mm,0.25μm），美国Agilent公司；FT1型乳成分分析仪，丹麦Foss公司；SHJ-1AB磁力搅拌水浴锅，长沙毫厘科技有限公司；箭型固相微萃取进样器及DVB/CAR/PDMS（120μm×20 mm）的SPME arrow萃取头，美国Agilent公司

1.3 实验方法

1.3.1 箭型固相微萃取法

在顶空瓶中称取10 g样品乳，加入磁力搅拌子和1 g氯化钠，用微量进样器吸取1μL质量浓度为0.816 mg/mL的内标物2-甲基-3-庚酮打入样品乳中。设置磁力搅拌水浴锅的温度为50℃、转速为300 rpm。密封好的顶空瓶放入水浴锅中加热平衡20 min后，将SPME Arrow的萃取头插入顶空瓶中，推出萃取纤维。待顶空吸附30 min后，缩回萃取纤维，并拔出萃取头，等待GC进样。

1.3.2 GC-MS分析方法

GC条件：毛细管柱的型号是30 m×0.25 mm，0.25μm的DB-WAX柱，以氦气作为载气，设置恒定流速为1.2 mL/min。色谱柱的升温程序为：起始柱温为35℃，溶剂延迟3 min，以5℃/min升温到210℃，保持1 min；然后以10℃/min升到230℃，保持1 min；采用不分流模式。

MS条件：电子电离（electron ionization,EI）源，电子能量70 eV；进样口温度为250℃，离子源温度为230℃，四极杆温度为150℃；全扫描模式，质量扫描范围是m/z35～350。

1.4 定性定量分析

1.4.1 定性分析

两种方法来定性化合物：首先是在NIST14谱库中检索、对比化合物；然后是计算化合物的保留指数并与文献中保留指数进行对比。保留指数的计算是将正构烷烃C7～C40与样品牛乳在相同的色谱条件下得出GC保留时间，根据公式计算待测化合物i的保留指数（tn＜ti＜tn+1）。

式中：RI为保留指数；ti为样品i的保留时间；n为碳原子数；tn+1为碳原子数为n+1的正构烷烃的保留时间；tn为碳原子数为n的正构烷烃的保留时间。

1.4.2 定量分析

利用内标半定量法来计算各挥发性风味化合物的含量，根据化合物与内标物质的峰面积比值来计算各挥发性风味化合物的含量。

2 结果与分析

本研究利用SPME Arrow萃取吸附巴氏杀菌乳、UHT灭菌乳和INF杀菌乳中挥发性风味组分，并借助GC-MS对这些风味物质进行分析和比较。分析结果显示：3类杀菌乳中共检测出78种挥发性风味物质，见表2。其中醛类物质最多有18种，其次是醇类14种，酮类12种，脂肪酸类11种等等。不同杀菌乳中挥发性化合物种类及质量分数存在明显差异。其中巴氏杀菌乳主要是醛类化合物，其次是脂肪酸类和芳香及杂环类化合物；UHT灭菌乳中醛类和脂肪酸类种类最多，其次是酮类和内酯类；INF杀菌乳则是醛类、脂肪酸类和醇类居多。对表2中各类物质分别讨论如下。

2.1 脂肪酸类化合物

脂肪酸类化合物的风味阈值较低，是牛乳中具有代表性的一类风味物质[5]。原料乳中游离脂肪酸主要有两种来源[6]：（1）瘤胃细菌分泌的乙酸和β-羟基丁酸在乳腺内合成了短链和中短链脂肪酸（C4-C10和C16的一半）；（2）更长的脂肪酸（C16或更长）则是从食物转移到乳腺中生成。3种杀菌方式的分析结果显示：巴氏杀菌乳中共检测出9种脂肪酸类化合物，UHT灭菌乳中10种，INF杀菌乳中10种，由此可见不同杀菌方式对脂肪酸类化合物的种类数量影响并不大。但部分脂肪酸类物质只存在于特定种类的杀菌乳中，如：丙酸只存在于INF杀菌乳中；庚酸只在UHT灭菌乳和INF杀菌乳中被检索出；而9-癸烯酸也只能在巴氏杀菌乳和UHT灭菌乳中获得。通过计算可知：UHT灭菌乳中脂肪酸总质量分数明显高于INF杀菌乳和巴氏杀菌乳。这与目前已有的结论相似：137℃，4 s加热处理后的UHT灭菌乳中脂肪酸质量分数明显增加[7]。3类杀菌乳中，己酸、辛酸和癸酸的质量分数都相对较高。其中，UHT灭菌乳中辛酸质量分数高达45.48μg/kg。这些中短碳链的脂肪酸在低浓度时具有奶香味，是牛乳中典型的挥发性风味组分。

2.2 内酯类化合物

内酯类化合物通常是加热后羟基化的脂肪酸经环化反应生成[8]，是牛乳整体风味形成中的重要一员。由表2可知：3类杀菌乳中共检测出7种内酯类物质。巴氏杀菌乳2种，UHT灭菌乳7种，INF杀菌乳3种，其中，δ-癸内酯和δ-十二内酯均存在于3类杀菌乳中。由上述结果可知：UHT灭菌乳中内酯类化合物数量上远高于INF乳和巴氏杀菌乳，这可能是因为UHT灭菌乳的高温处理更容易生成内酯类风味化合物[9-10]。内酯类物质与滋气味和风味有着密切关系，其能赋予牛乳愉悦的脂肪香气，如椰奶味、桃子味等。内酯类物质能赋予牛乳良好的风味[11]，其对提高牛乳的感官品质具有积极作用。3类杀菌乳中，δ-癸内酯的质量分数均为最高，在UHT灭菌乳、INF杀菌乳和巴氏杀菌乳中分别是5.85、4.68μg/kg和1.40μg/kg。此外，由表2可知，UHT灭菌乳中内酯类总质量分数明显高于INF杀菌乳和巴氏杀菌乳，这表明内酯类组分是形成UHT灭菌乳的主要风味化合物，其对UHT灭菌乳的风味具有重要贡献[11]。

2.3 酮类化合物

酮类物质作为牛乳中最常见的风味化合物，其感知阈值低、风味特别，是牛乳风味组分中关键的一员[12-13]。牛乳中酮类物质主要有两种产生途径：第一种是天然存在于生牛乳中；第二种则是饱和脂肪酸或β-酮酸在高温处理过程中通过氧化脱羧生成。由表2可知，3种杀菌方式的牛乳中共检测出12种酮类物质。UHT灭菌乳9种，INF杀菌乳6种，巴氏杀菌乳6种。UHT灭菌乳中酮类物质总质量分数和种类均远高于INF杀菌乳和巴氏杀菌乳，这与相关组分高温生成机制有关。此外，部分酮类物质只存在于一类杀菌乳中。如2-戊酮只存在于UHT灭菌乳中，4-辛酮也只存在于巴氏杀菌乳中。部分物质虽然存在于3类杀菌乳中，但其质量分数有着较大的区别。如常见的甲基酮类物质2-壬酮和2-庚酮：2-壬酮在UHT灭菌乳中质量分数高达35.64μg/kg，INF杀菌乳中为4.91μg/kg，巴氏杀菌乳中则为2.35μg/kg。2-壬酮感知阈值较低，仅为0.02 mg/kg，具有的热牛奶味道对牛乳的感官品质起着积极作用；2-庚酮在UHT灭菌乳中质量分数为36.50μg/kg，INF杀菌乳中1.76μg/kg，巴氏杀菌乳中则为2.68μg/kg。这与V-L等人[14]研究的结论一致：UHT灭菌乳中，2-壬酮和2-庚酮的质量分数远高于巴氏杀菌乳。除了质量分数和种类上的差异，UHT灭菌乳还会赋予牛乳多种独特的香气物质，如：由亚油酸氧化产生的2-庚酮，就赋予UHT灭菌乳奶油香气，其既是UHT灭菌乳风味物质的主要组成部分，也是UHT灭菌乳中独特的风味化合物；2-戊酮则具有轻微的乳样香气和果香甜味[15]。

2.4 醛类化合物

醛类物质的气味阈值一般都较低，如常见的辛醛，其阈值是0.587μg/kg，反-2-壬烯醛的阈值为0.19μg/kg，而十二醛的阈值仅为0.14μg/kg。但醛类物质在食品中起着关键作用并且可以作为一种风味前体通过化学反应产生各种氧化风味组分[16]。Strecker降解、氨基酸的转氨作用以及脂肪酸的代谢产生了醛类物质[14]。3种杀菌方式的分析结果表明：UHT灭菌乳中共检测出11种醛类化合物，INF杀菌乳12种，巴氏杀菌乳13种。其中糠醛和肉桂醛只在UHT灭菌乳中被检索到，反式肉桂醛和反-2-癸烯醛也只在INF杀菌乳中被发现，丙醛、庚醛和十一醛只在巴氏杀菌乳中出现。且通过计算可知：3类杀菌乳中，壬醛、癸醛和苯甲醛的含量占比都较高。如：UHT灭菌乳中，壬醛质量分数高达4.95μg/kg，占其醛类总质量分数的23.5%；INF杀菌乳中壬醛质量分数为18.67μg/kg，占其醛类总质量分数的46.3%；巴氏杀菌乳中壬醛质量分数为67.40μg/kg，占其醛类总质量分数的67.6%。醛类物质作为加热后的牛乳中香气组分的重要贡献者，其风味独特。常见的醛类物质中，苯甲醛有水果香、坚果香，呈现出苦杏仁香味和焦味，对牛乳整体风味的形成起着重要作用[7]；糠醛则有面包香和焦香，带有烘烤食物的味道；庚醛是坚果香气；己醛则是强烈的青草和果木香气[17]。

2.5 醇类化合物

在牛乳中，相应的醛类物质通常会通过物理作用或者是酶作用生成醇类物质[18]。醇类物质具有植物香、芳香、土气和酸败味，但其阈值较高，除非是在不饱和状态或者是以高浓度存在时，才会对牛乳的风味做出贡献[16]。由表2可知：UHT灭菌乳和INF杀菌乳中醇类物质种类上略高于巴氏杀菌乳，而INF杀菌乳中醇类物质的总质量分数则高于巴氏杀菌乳和UHT灭菌乳。3类杀菌乳中，均存在1-辛醇、芳樟醇、十二醇和十四醇。醇类化合物对牛乳香气的影响几乎可以忽略不计，因为它们的味道相对较弱[18]。

2.6 酯类化合物

牛乳加热过程中脂肪酸发生了一系列化学反应，生成了酯类物质。酯类物质通常是短链脂肪醇和游离脂肪酸通过酯化反应获得[5]。如：常见的乙酸乙酯就是牛乳加热过程中，乙酸和乙醇通过酯化反应获得[19]。由C1～C20脂肪酸组成的甲酯或乙酯类是牛乳中主要的酯类物质[15]，其对牛乳风味有一定的影响[20-21]。由表2可知：UHT灭菌乳和INF杀菌乳中均只检测出十六酸甲酯这一酯类物质，这与杨楠等人[15]检测的结果相似。除十六酸甲酯外，巴氏杀菌乳中还检测出丁酸丁酯、己酸乙酯和己酸丁酯，这可能与其较高的脂肪含量有关。3类杀菌乳中，酯类化合物总质量分数均较低，INF杀菌乳中酯类总质量分数是1.35μg/kg，巴氏杀菌乳是3.23μg/kg，UHT灭菌乳中仅为0.42μg/kg。

2.7 含硫化合物

含硫化合物感知阈值较低，是加热后牛乳产生蒸煮味道（cooked flavor）的重要原因，因而含硫化合物对乳制品风味的影响较大。挥发性硫化物主要通过乳清蛋白因加热变性而暴露的甲硫氨酸中的巯基发生Strecker降解生成。如甲硫醇就来自于甲硫氨酸和核黄素的Strecker降解[22]，甲硫氨酸的Strecker降解也产生了痕量的二甲基二硫和二甲基硫[23]，此外，其它含硫化合物如硫化氢，除了甲硫氨酸的降解外[24]，还有两种可能的形成机制：双酮存在下的半胱氨酸的Strecker降解或者是硫胺的热降解[22]。由表2可知：UHT灭菌乳中共检测出二甲基三硫和二甲基砜这两种含硫化合物，其中二甲基三硫具有硫磺味和卷心菜的味道，对牛乳风味有一定的贡献，尤其被认为是UHT灭菌乳中含硫风味的主要来源[23]；INF乳中则只有二甲基砜；巴氏杀菌乳中是二甲基三硫和二甲基亚砜，其中二甲基亚砜具有硫磺味和大蒜味。此外，3类杀菌乳中，含硫化合物的总含量相差也不大。

2.8 3类杀菌乳中主要香气化合物组分的OAV分析

将表2中鉴定得到的风味化合物进行OAV计算（阈值见文献），其中OAV>1的物质如表3所示。UHT灭菌乳中，OAV值在1-10的化合物主要是内酯类、酮类和醛类等化合物，包括γ-十二内酯（OAV=1.63），顺式-4-羟基-6-十二烯酸内酯（OAV=4.20），2-庚酮（OAV=1.22），2-壬酮（OAV=1.78），2-十一酮（OAV=2.91），辛醛（OAV=3.75），壬醛（OAV=4.50），十二醛（OAV=5.86），二甲基三硫（OAV=2.20）。INF杀菌乳中，OAV大于10的是1-辛烯-3-酮和壬醛，分别是73.33和16.97；OAV在1-10的化合物主要是醛类和醇类，包括辛醛为4.82，反-2-壬烯醛是4.53，芳樟醇是1.00。巴氏杀菌乳中，OAV大于10的化合物是辛醛和壬醛，其OAV值分别是13.83和61.27；OAV在1-10的化合物主要是酯类和醛类，包括己酸乙酯（OAV=1.33），庚醛（OAV=1.41），癸醛（OAV=2.33），反-2-壬烯醛（OAV=7.26），十二醛（OAV=7.50），芳樟醇（OAV=2.18），二甲基三硫（OAV=2.90）。

表2 UHT灭菌乳、INF杀菌乳和巴氏杀菌乳的化合物定量结果

（续表2）

（续表2）

3类杀菌乳中，均有2-庚酮、2-壬酮、2-十一酮、辛醛、壬醛、癸醛、芳樟醇这7种化合物。此外，乙酸乙酯和庚醛只存在于巴氏杀菌乳中，γ-十二内酯和顺式-4-羟基-6-十二烯酸内酯也只出现在UHT灭菌乳中。1-辛烯-3-酮只存在于INF杀菌乳中。十二醛和二甲基三硫也只出现在UHT灭菌乳和巴氏杀菌乳中。其中，1-辛烯-3-酮因其感知阈值低，仅为0.003μg/kg，其在INF杀菌乳中OAV值大于10，为INF杀菌乳贡献了蘑菇般的气味；3类杀菌乳中，壬醛的OAV值均较大，其为3类杀菌乳贡献了脂肪香气。且由表3可知，UHT灭菌乳的整体风味主要是由内酯类和酮类组成，INF杀菌乳则是由酮类构成，醛类物质构成了巴氏杀菌乳的整体风味。

表3 牛乳中化合物的OAV值

2.9 3类杀菌乳中挥发性风味组分的热图分析

进一步探讨不同杀菌方法对牛乳中特征香气物质的影响，将表3所列的挥发性风味组分的OAV值进行热图分析，得到如图1所示结果。图中蓝色越深表示对牛乳风味贡献越大，红色越深表示对牛乳风味贡献越小。由图1可以看出，巴氏杀菌乳中，醛类化合物对其整体风味影响最大，以辛醛、壬醛、反-2-壬烯醛和十二醛为代表的特征香气物质基本构成了巴氏杀菌乳的整体风味；UHT灭菌乳中主要挥发性风味化合物是内酯类、酮类和醛类，其中γ-十二内酯、顺式-4-羟基-6-十二烯酸内酯、2-壬酮、2-十一酮以及辛醛、壬醛等特征香气物质构成了UHT灭菌乳的整体风味；以1-辛烯-3-酮和壬醛为代表的酮类和醛类物质基本构成了INF杀菌乳的整体风味。

3 结论

本文通过SPME Arrow-GC-MS对3种杀菌方式的牛乳进行分析，得出以下结论：3类杀菌乳中共检测到78种挥发性风味物质，其中脂肪酸类11种、酯类4种、内酯类7种、酮类12种、醛类18种、醇类14种、含硫化合物2种、芳香及杂环类化合物10种。其中OAV>1的风味物质共15种，利用这15种挥发性风味物质的OAV值做热图分析，分析结果显示：不同杀菌乳中特征香气物质存在明显差异。巴氏杀菌乳中，醛类化合物对其整体风味影响最大，以辛醛、壬醛、反-2-壬烯醛和十二醛为代表的风味化合物基本构成了巴氏杀菌乳的整体风味；UHT灭菌乳中主要挥发性风味化合物是内酯类、酮类和醛类，其中γ-十二内酯、顺式-4-羟基-6-十二烯酸内酯、2-壬酮、2-十一酮以及辛醛、壬醛等特征香气物质构成了UHT灭菌乳的整体风味；以1-辛烯-3-酮和壬醛为代表的酮类和醛类物质基本构成了INF杀菌乳的整体风味。