呼吸道合胞病毒毛细支气管炎婴幼患儿外周血miR-155与PDCD4表达的相关性研究

王刚，王琼，姜昕，郑静

毛细支气管炎属下呼吸道感染性疾病，临床症状主要为咳嗽、喘憋，因婴幼儿的免疫抵抗力较差，因此该疾病多发人群以婴幼儿为主［1］。其中，由呼吸道合胞病毒（RSV）诱发的毛细支气管炎占比较大。病情较轻的患儿经治疗后可恢复，严重者如未得到及时有效治疗则可能发展为肺气肿、哮喘甚至死亡，严重威胁婴幼儿的生命健康［2］。目前尚未发现诊断RSV 毛细支气管炎的有效因子，因此寻找生物标志物十分必要。微小RNA（miRNA）是一类高度保守的小RNA，通过与其靶基因特异性结合，调控人类约30%的基因表达，在多种生理和病理过程中发挥重要作用，其中miR-155 是其家族中重要的一员［3］。有研究表明，RSV 肺炎婴幼儿外周血miR-155 水平升高，且miR-155 水平与炎性因子呈正相关［4］。程序性细胞死亡因子4（PDCD4）在多种肿瘤中发挥抑瘤作用，参与细胞周期、增殖、凋亡等过程。PDCD4受多种miRNA的调控。有研究发现，糖尿病肾病血管钙化患者血清miR-155 和PDCD4 mRNA呈显著负相关，且两者之间存在结合位点，推测可能是miR-155 通过靶向PDCD4 影响糖尿病肾病患者发生血管钙化［5］。目前，关于miR-155 和PDCD4 在RSV 毛细支气管炎中的研究较少。本研究拟探究RSV毛细支气管炎婴幼儿外周血miR-155与PDCD4表达的关系，旨在为该疾病的诊治提供一定的参考。

1 对象与方法

1.1 研究对象 以2018 年2 月—2021 年2 月上海浦滨儿童医院儿内科收治的106 例RSV 毛细支气管炎婴幼儿为研究组，其中男57 例，女49 例，年龄36 d～36 个月，平均（6.32±1.74）个月。按照《毛细支气管炎诊断、治疗与预防专家共识（2014 年版）》［6］分为轻症组36 例、中症组41 例和重症组29例。纳入标准：（1）符合《诸福棠实用儿科学》中RSV 毛细支气管炎的诊断标准［7］。（2）从发病到入院≤3 d。（3）年龄≤36个月。（4）鼻咽部RSV检查阳性。（5）双肺伴有湿啰音和哮鸣音。排除标准：（1）患有先天免疫系统疾病者。（2）伴有心、肝、肾疾病者。（3）2周内服用过糖皮质激素及抗菌药物者。（4）精神系统紊乱、不能积极配合治疗者。另选择同期在本院儿保门诊健康体检的婴幼儿65 例为对照组，体检结果正常，排除2周内服用过糖皮质激素及抗菌药物者，其中男36 例，女29例，年龄38 d～36 个月，平均（6.65±1.79）个月。2 组性别（χ2=0.042）、年龄（t=1.175）比较差异无统计学意义（均P＞0.05），具有可比性。本研究经婴幼儿家属签署知情同意书，并经上海浦滨儿童医院伦理委员会批准。

1.2 主要试剂与仪器 Trizol 试剂（广州东盛生物科技有限公司）；RNA 逆转录试剂盒（北京泰泽嘉业科技发展有限公司）；miScript SYBR®Green qPCR 试剂盒（上海恒斐生物科技有限公司）；miR-155、U6 引物（广东文华氏生物科技有限公司）；人PDCD4酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（上海仁捷生物科技有限公司）；人超敏C反应蛋白（hs-CRP）、白细胞介素（IL）-6、IL-10、肿瘤坏死因子（TNF）-α ELISA试剂盒（上海广锐生物科技有限公司）；PCR仪（上海净信实业发展有限公司）。

1.3 研究方法

1.3.1 样品采集 采集各组婴幼儿空腹外周静脉血3～5 mL，3 000 r/min离心10 min，取上清液于-80 ℃保存备用。

1.3.2 血清miR-155水平检测 在血清样品中加入Trizol试剂提取总RNA。将RNA 反转录为cDNA，利用miScript SYBR®Green qPCR 试剂盒进行实时荧光定量PCR（qPCR）反应。反应条件：95 ℃60 s；95 ℃15 s，63 ℃30 s，72 ℃15 s，共40 个循环，以U6为miR-155的内参，其相对表达量采用2-ΔΔCt法计算，引物序列见表1。

Tab.1 qPCR primer sequence表1 qPCR引物序列

1.3.3 血清PDCD4 及炎性因子水平检测 采用ELISA 法检测血清PDCD4 及炎性因子hs-CRP、IL-6、IL-10、TNF-α 水平，其试验操作均严格按照ELISA试剂盒说明书进行。

1.4 统计学方法 采用软件SPSS 23.0处理数据。计数资料以例表示，2 组间比较行χ2检验；计量资料以均数±标准差（±s）表示，2组间比较行t检验，多组间比较行单因素方差分析，多重比较采用SNK-q检验。Pearson 相关分析RSV 毛细支气管炎婴幼儿血清miR-155和PDCD4的关系，以及两者与炎性因子的相关性。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组婴幼儿血清miR-155 和PDCD4 表达水平比较 与对照组相比，研究组患儿血清miR-155 水平升高，PDCD4水平降低（P＜0.01），见表2。

Tab.2 The serum expression levels of miR-155 and PDCD4 in the two groups of infants表2 2组婴幼儿血清miR-155、PDCD4表达水平（±s）

Tab.2 The serum expression levels of miR-155 and PDCD4 in the two groups of infants表2 2组婴幼儿血清miR-155、PDCD4表达水平（±s）

＊＊P＜0.01。

组别对照组研究组t n 65 106 miR-155/U6 1.02±0.18 2.14±0.36 23.339＊＊PDCD4（µg/L）4.97±0.96 2.84±0.41 20.078＊＊

2.2 病情轻、中、重3 组患儿血清miR-155 和PDCD4 表达水平比较 与轻症组婴幼儿相比，中症组血清miR-155 水平上升，PDCD4 水平下降（P＜0.05），与中症组相比，重症组miR-155 水平上升，PDCD4水平下降（P＜0.05），见表3。

Tab.3 Expression levels of serum miR-155 and PDCD4 in the three groups of infants表3 3组患儿血清miR-155、PDCD4表达水平（±s）

Tab.3 Expression levels of serum miR-155 and PDCD4 in the three groups of infants表3 3组患儿血清miR-155、PDCD4表达水平（±s）

＊＊P＜0.01；a与轻症组比较，b与中症组比较，P＜0.05。

组别轻症组中症组重症组F n 36 41 29 miR-155/U6 1.71±0.26 2.01±0.31a 2.85±0.56ab 75.469＊＊PDCD4（µg/L）4.19±0.62 2.44±0.34a 1.74±0.26ab 276.596＊＊

2.3 2组婴幼儿血清炎性因子水平比较 与对照组相比，研究组患儿血清炎性因子hs-CRP、IL-6、IL-10、TNF-α水平均上升（P＜0.01），见表4。

Tab.4 Comparison of serum inflammatory factors between the two groups表4 2组婴幼儿血清炎性因子水平比较 （±s）

Tab.4 Comparison of serum inflammatory factors between the two groups表4 2组婴幼儿血清炎性因子水平比较 （±s）

＊＊P＜0.01。

组别对照组研究组t n 65 106 hs-CRP（mg/L）131.39±30.27 225.43±49.36 13.838＊＊IL-6（ng/L）109.61±21.47 196.93±33.85 18.616＊＊IL-10（ng/L）116.96±28.59 189.33±31.47 15.105＊＊TNF-α（ng/L）4.02±1.16 5.67±1.54 7.438＊＊

2.4 血清miR-155 与PDCD4 及两者与炎性因子的关系 生物信息学网站ENCORI 显示，miR-155 和PDCD4 之间存在结合位点，见图1。且Pearson 相关性分析显示，两者水平呈负相关（r=-0.790，P＜0.01）。此外，血清miR-155 水平与炎性因子hs-CRP、IL-6、IL-10、TNF-α 均呈正相关（r分别为0.561、0.701、0.651 和0.676，均P＜0.01），PDCD4 与上述炎性因子均呈负相关（r分别为-0.580、-0.752、-0.713和-0.671，均P＜0.01）。

Fig.1 Binding site map between miR-155 and PDCD4图1 miR-155和PDCD4之间的结合位点图

3 讨论

3.1 RSV 毛细支气管炎研究目的及意义 毛细支气管炎是由细菌、病毒、支原体等多种病原体引发的感染性疾病，RSV 是感染较多的病原体，约占36.32%，该病多发于3岁以下的婴幼儿，由于该类人群免疫力差，容易反复感染，伤及肺部［8-9］。因此，探究可以准确诊断RSV毛细支气管炎以及评估患儿病情发展状况的辅助指标具有积极意义。

3.2 血清miR-155 表达与RSV 毛细支气管炎发展及炎症指标的关系 miRNA 是长为20～25 nt 的小RNA，具有一定的内源性，参与调控细胞的增殖、分化、凋亡等重要生理过程，miRNA 在基因网络中与多种靶基因形成调控网，通过降解mRNA 参与多种疾病的发生、发展过程［10］。多种miRNA在机体炎症反应中发挥重要作用［11］。miR-155 是一种多功能miRNA，其作为促炎基因通过多种调控过程参与炎性疾病的发展［4］。冯琼等［12］研究表明，与对照组相比，新生儿肺炎患者血清miR-155水平明显上调，经治疗后其水平显著降低，且miR-155 水平与炎性因子降钙素原（PCT）、IL-6水平呈正相关，对新生儿肺炎有一定的诊断价值。Arroyo 等［13］研究发现，RSV感染患儿鼻腔样本中miR-155水平较对照组明显升高，且过表达的miR-155 与患儿呼吸道疾病严重程度有关。在本研究中，研究组婴幼儿血清miR-155水平显著升高，且miR-155 水平随着RSV 毛细支气管炎严重程度加重而明显上升，与Arroyo 等［13］研究结果一致，提示miR-155 参与了RSV 毛细支气管炎的发生和发展。此外，本研究结果显示研究组患儿血清炎性因子hs-CRP、IL-6、IL-10、TNF-α 水平均上升，且其水平与miR-155 水平均呈正相关。这与黄佩等［14］研究结果一致，提示miR-155 可作为辅助指标与常见炎性因子共同监测RSV下呼吸道感染疾病的发生。

3.3 血清PDCD4 表达与RSV 毛细支气管炎发展及炎症指标的关系 PDCD4 是新型的肿瘤抑制因子，广泛表达于多种组织，在多种肿瘤中抑制癌细胞的生长，并促进其凋亡。有研究发现，下调的PDCD4可为肿瘤生长创造适宜的环境［15］。另有研究表明，冠心病心源性猝死患者心肌组织中PDCD4 水平呈低表达，推测其作用与调控炎症反应密切相关［16］。Wang 等［17］研究发现，缺乏PDCD4 可上调促炎因子（如IL-6）表达，加重急性结肠炎病情，进而诱发向结直肠癌演变。本研究中，研究组婴幼儿血清PDCD4水平较对照组显著降低，且其水平随着RSV 毛细支气管炎严重程度加重而明显下调，提示PDCD4在该病的发生、发展中发挥调控作用。PDCD4与炎性因子均呈负相关，推测PDCD4在RSV毛细支气管炎中可能发挥抑制炎症的作用。Xia等［18］研究发现，多囊卵巢综合征患者卵巢组织中miR-155 呈高表达，且miR-155 靶向负调控PDCD4，从而促进人卵巢颗粒细胞株（KGN）的增殖、迁移和侵袭。Liu等［19］研究表明，非小细胞肺癌细胞中miR-155表达上调，PDCD4表达下调，表明miR-155可通过直接靶向PDCD4发挥致癌作用。结合本研究，生物信息学分析显示miR-155 和PDCD4 有结合位点，相关性分析显示两者水平呈负相关，提示miR-155与PDCD4共同参与该疾病的进展。

综上所述，RSV毛细支气管炎婴幼儿血清miR-155和PDCD4水平异常表达，两者呈负相关关系，且其水平与炎性因子密切相关，有望成为早期检测病情发展的辅助生物标志物。但本研究样本量偏少，且缺少机制方面的研究，下一步研究将扩大样本量，补充动物实验，为RSV 毛细支气管炎的诊治和病情评估提供更加详实的数据参考。