基于网络药理学及分子对接研究探索生姜泻心汤治疗化疗相关腹泻的作用机制

高 宇，孙建荣，邓 超，贾立群

（1.北京中医药大学，北京，100029；2.中日友好医院，北京，100029）

化疗相关腹泻（chemotherapy-induced diarrhea，CID）主要指应用5 氟尿嘧啶（5-FU）和伊立替康等化疗药物时或治疗后出现的腹泻，是临床常见的化疗不良反应，不仅严重影响治疗的疗效和完成，严重者甚至会出现脱水和电解质紊乱等危及生命的症状，给肿瘤患者带来巨大的健康和经济损害［1，2］。文献显示，肿瘤患者因化疗引起腹泻（3～4 级）的发生率为10%～20%，应用5 氟尿嘧啶（5-FU）和伊立替康的腹泻发生率尤其高［3］。伊立替康是喜树碱的半合成衍生物，是一种无活性前体药物，经肝脏代谢后进入肠道，经β-葡萄糖苷酶转化为可以损伤肠道的活性产物SN-38，引起迟发性腹泻［4］。目前临床常规治疗为奥曲肽、洛哌丁胺、思密达等抑制肠蠕动，保护肠黏膜。中药作为防治CID 的手段之一，已通过前期临床试验和基础实验初步证实了其有效性。生姜泻心汤出自《伤寒论》，由甘草、党参、干姜、半夏、黄芩、黄连、生姜、大枣组成，主治水饮食滞互结，胃中不和所致的“心下痞硬，干噫食臭，胁下有水气，腹中雷鸣，下利者［5］。”本课题团队历经10 余年研究，前期临床观察显示生姜泻心汤可显著降低伊立替康CID 的发生率，尤其对于UGT1A1基因突变的腹泻高危人群［6，7］；同时，依托国家自然科学基金项目对其机理进行了探索，发现生姜泻心汤可通过促进肠细胞增殖、抑制肠细胞凋亡等机制改善伊立替康所致的肠道黏膜损伤［8-10］。

本研究采用网络药理学研究策略，构建“药物成分-作用靶点-作用通路”多维网络，探讨其治疗CID 的作用机制，实现对中药复方作用机制的预测和分析，为进一步开展基础研究提供参考。

1 资料与方法

1.1 药物活性成分筛选及作用靶点预测

通过TCMSP 数据库检索半夏、大枣、党参、甘草、干姜、黄连、此同时黄芩以及生姜的化合物成分［11］。成分筛选条件为口服生物利用度OB≥30%，药物相似性DL≥0.18。将符合条件的化合物成分通过TCMSP 数据库进行成分的靶点预测。

1.2 化疗相关腹泻靶点查找

以“chemotherapy induced diarrhea”为关键词，在GeneCards 数据库与NCBI 基因数据库中进行人类基因检索。其中GeneCards 的数据将Relevance score 进行中位值的筛选以获得疾病相关性更高的靶点［12，13］。将两个数据库得到的检索结果进行整合重后，建立CID 的预测靶点库。

1.3 药物-疾病靶点筛选与蛋白互作网络-PPI构建

将筛选出的生姜泻心汤的药物靶点与CID 靶点输入韦恩图制作软件Venny 2.1，交集得到的共有靶点作为药物作用于疾病的预测靶点。药物-化合物成分-作用靶点-疾病网络采用Cytoscape 3.8.0 软件构建。

设置参数，将生物种类设定为“Homo sapiens”，可信度设置为>0.9，将生姜泻心汤-CID 共有靶点输入String 数据库进行PPI 网络的构建，得到PPI网络［14］。

1.4 GO 富集分析和KEGG 富集分析

GO 数据库（Gene Ontology），将基因功能分成了3 个部分，分别是：细胞组分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）、生物过程（biological process，BP）。使用用GO 数据库，可以在CC、MF、BP 3 个层面上获得目标基因在的富集，并对药物疾病共有靶点进行KEGG 通路富集分析。引用String 数据库，设置校正P值<0.05，对项目进行筛选。条形图和气泡图绘制使用R 3.6.3 软件“clusterProfiler”，“enrichplot”，“ggplot2”包。根据富集基因数目降序排列，选取富集基因数目位居前列的生物学过程和通路作为本次研究的主要讨论对象。

1.5 潜在作用靶点与关键通路网络构建

在文本文件（txt 中）将生姜泻心汤-CID 共同靶点均按照数据、属性文件进行数据编排后，与参与CID 的20 条KEGG 通路共同输入到Cytoscape 3.8.0 软件中，构建潜在作用靶点与KEGG 通路网络关系。

1.6 分子对接

根据拓扑学参数获得核心药物成分，化合物的SDF 结构可以从Pubchem 网站获得，使用Open Ba⁃bel 2.3.2 软件将SDF 文件转化为PDB 文件。受体蛋白从Protein Data Bank 数据库中检索获得，利用PYMOL 2.3.4 软件对受体蛋白进行去水、去配体等操作，对受体蛋白进行加氢、平衡电荷等修饰采用AutoDockTools 软件，用Grid 程序下的Grid Box 命令打开Grid Option 工具对每个受体蛋白进行处理，配体结合口袋的大小由各个方向上格点的数目和格点间距共同决定，因此调整各个蛋白每个方向上格点的数目、结合口袋的中心以及格点的间距，采用Autodock vina 1.1.2 进行半柔性对接。

2 结果

2.1 生姜泻心汤的有效成分

设置OB%≥30%、DL≥0.18 为筛选条件，在TCMSP 数据库中汇总去重得到：大枣有29 个化合物成分，199 个靶点；半夏获得13 个化合物成分，93个靶点；黄芩获得36 个化合物成分，110 个靶点；党参获得21 个化合物成分，106 个靶点；甘草获得93个化合物成分，215 个靶点；干姜获得5 个化合物成分，43 个靶点；黄连获得14 个化合物成分，175 个靶点；半夏获得13 个化合物成分，93 个靶点；生姜获得5 个化合物成分，54 个靶点。将化学成分整理去重后，共得到化合物成分229 个，其中OB%排名前20的成分信息如下（表1）。去重后获得上述化学成分的有效靶点276 个。

表1 生姜泻心汤活性化合物信息表Tab 1 Active components of Shengjiang Xiexin decoction

2.2 化疗相关腹泻靶点查找

在GeneCards 数据库，NCBI 基因数据库进行人类基因检索。其中GeneCards 的数据将Relevance score 进行中位值的筛选以获得相关性更强的靶点。在NCBI 数据库检索获得39 条基因，在GeneCards数据库获得相关基因1 761 条。将这2 个数据库的基因合并删重之后，得到1 764 个相关基因，建立CID 的预测靶点库。疾病基因还需和药物作用靶点取交集，进而获得药物对疾病的潜在治疗靶点。

将“2.1”中筛选出的276 个药物靶点与本次筛选得到的1 764 个疾病靶点输入韦恩图制作软件Venny 2.1，获得173 个共有靶点，作为药物作用于疾病的预测靶点，见图1。

图1 药物⁃疾病共有靶点筛选韦恩图Fig 1 Venny map of intersection target of drug-disease

2.3 PPI 网络构建及可视化分析及中药-成分-疾病-通路-靶点网络构建

笔者以筛选的成分、治疗疾病以及作用靶点为基础，构建了成分-疾病-靶点网络图，采用cytoscape 3.8.0 软件得到中药成分-作用靶点网络图（图2）。这样的构建可以更好的理解药物成分，疾病靶点之间的复杂相互作用关系。将生物种类设定为“Ho⁃mo sapiens”，可信度设置为>0.9，将韦恩图得到的173 个药物疾病共有靶点输入String 数据库进行PPI 网络的构建。得到PPI 网络。该网络中有173个节点，794 条边，平均度值为9.18。图3 为string 网站导出的PPI 网络图导入cytoscape 软件绘制的PPI网络图，其中节点颜色和大小根据度值调整，越大，颜色越深，度值越大，线的粗细，从粗到细表示edge betweenness 从大到小。

图2 中药成分-作用靶点网络图Fig 2 Network diagram of active components-effective targets

图3 Cytoscape 绘制PPI 网络图Fig 3 PPI network diagram analyzed with Cytoscape

2.4 靶点功能通路富集分析

将药物疾病共有靶点进行GO 的BP、MF、CC富集，设定校正P值≤0.05，引用String 数据库，筛选后总共富集到79 项细胞组分，2 427 条生物过程，168 项分子功能。共同作用靶点在细胞组成（CC）中主要富集条目为膜筏、膜微区、膜区等。共同作用靶点在分子功能（MF）中主要富集条目为细胞因子受体结合、DNA 结合转录因子结合、细胞因子活性等。共同作用靶点在生物过程（BP）中，主要富集条目为脂多糖应答、氧化应激反应、对细菌来源分子的反应、化学应激反应等。绘制柱状图和气泡图使用R3.6.3 包，见图4、5。

图4 GO 富集分析（柱状图）Fig 4 GO enrichment analysis diagram（bar charts）

将生姜泻心汤-CID 共有靶点进行KEGG 通路富集分析，总共富集到169 条信号通路。使用R 3.6.3，安装并引用clusterProfiler 包后，进行气泡图绘制，见图6。具体信息见“KEGG 富集表”主要涉及Toll 样受体信号通路、肿瘤坏死因子（TNF）信号通路、乙型肝炎（Hepatitise B）信号通路、A 型流感病毒（Inlfuenza A）通路、小细胞肺癌相关通路等信号通路。将生姜泻心汤-作用成分-化疗相关腹泻-信号通路-作用靶点网络文件导入Cytoscape3.8.0 进行通路网络图的绘制。更直观地展示中药活性成分在治疗CID 过程中的多成分-多靶点的作用特点，见图7。

图5 GO 富集分析（气泡图）Fig 5 GO enrichment analysis（bubble diagram）

图6 KEGG 富集分析（气泡图）Fig 6 KEGG enrichment analysis（bubble diagram）

图7 中药-成分-疾病-通路-靶点网络构建Fig 7 Drugs-ingredients-disease-pathway-target network diagram

2.5 拓扑分析获得疾病核心靶点

将PPI 网络导入Cystoscape 3.8.0［15］中，设置de⁃gree，betweenness centrality，average shortest path length 和closeness centrality 参数，采用Network Analyzer 工具进行拓扑分析。按degree 值排序，选取分值大于平均分的基因作为关键靶点，总共筛选出个58 关键靶点，20 个核心靶点分别为STAT3、AKT1、MAPK3、JUN、MAPK1、RELA、IL6、MAPK14、MAPK8、APP、EGFR、VEGFA、FOS、ESR1、CCND1、CTNNB1、CXCL8、EGF、MYC、RB1。将前20 个关键靶点采用R 3.6.3 进行图片绘制，横坐标为每个靶点的度值，见图8。

图8 关键靶点筛选Fig 8 Selection of key targets

2.6 中药复方的关键成分筛选

采用cytoscape 3.8.0，将成分-疾病-靶点网络图进行拓扑分析。将成分进行degree 的排序，将大于平均度值的成分筛选出来作为关键成分（degree 值越高成分越重要），见表2。

表2 关键成分信息表Tab 2 Key components

续表

2.7 分子对接

选取度值排名靠前的21 个化合物与排名前10的关键基因进行对接，结果显示结合能（affinity）均小于−5 kcal/mol，说明受体与配体可以自发结合，提示有较强的结合活性。将受体蛋白与配体分别进行分子对接，采用AutoDock Vina 1.1.2 软件。亲和力结果以亲和能（affinity）形式表示，亲核能值越高表示结合越差，能值越低，二者的结合效果越好。亲和能打分综合氢键、排斥作用、疏水作用、复合物空间效果。挑选代表性结合能打分及对接参数如表3 所示。

表3 生姜泻心汤中活性成分与关键靶点结合能预测Tab 3 Binding capability prediction of active ingredients of Shengjiang Xiexin decoction and the key targets

受体蛋白与配体小分子之间均可形成氢键相互作用和疏水相互作用，说明活性成分与靶蛋白具有较强的亲和力，且结合体构象稳定，见图9a～j。

图9 分子对接示意图Fig 9 Molecular docking visualization

3 讨论

CID 临床发生率在50%～80%［16］，给患者的治疗和生活质量带来了严重的影响。细胞毒性化疗药物可抑制癌细胞的增殖，但同时也会对其他组织和器官产生毒性和副作用。有效防治CID 是亟待解决的关键临床问题。目前研究发现CID 发生的机制涉及肠道炎症反应、细胞凋亡等［17，18］。

CID 属于中医“泄泻”、“下利”范畴，目前临床对CID 的病机认识多为寒湿下注，虚寒凝结，寒热错杂，多责之本虚标实。恶性肿瘤患者病程较长，受癌毒侵袭日久后耗伤正气，气血阴阳失调，脏腑功能失常，故为本虚；化疗药毒多伤及正气，在杀伤肿瘤时对患者自身尤其是胃肠道的损害极大，故见标实。常见泄泻选方有用生姜泻心汤、参苓白术散、四神丸、藿香正气丸等。泄泻病位在肠道，伊立替康引起的肠间质水肿就是中医说的水蓄三焦，故治疗上以调和中焦脾胃为主，配合采用温中化饮、健脾燥湿等治法，多采用生姜泻心汤、甘草泻心汤等。生姜泻心汤作为《伤寒论》中的三泻心汤方之一，在临床应用广泛，疗效显著，造福众多患者。CID 的基本病机基本病机水饮郁热，寒热错杂。“诸呕吐酸，暴注下迫，皆属于热”，所以用黄芩、黄连清热，治法上亦应重点考虑“疏利”。水饮本是阴邪，所以要用半夏、干姜与大剂量生姜温化水饮，如“病痰饮者当以温药和之”，水饮阻滞气机，郁而化热，所以出现“腹中雷鸣自下利”，故以黄芩黄连去清除郁热。再结合临床分析，如伊立替康引起的腹泻临床常见腹中雷鸣症状，患者经常自诉腹中肠鸣，腹泻稀水样便，便是热迫水饮的表现，并见口苦咽干，属于肝经郁热。腹泻伴有肛门坠胀，于马桶上久坐不起，“湿性重着”、“湿为阴邪，易袭阴位”，肛门坠胀是正气不足、湿邪下注的表现，肛门坠重是水湿，故采用半夏、生姜、干姜。参枣草共奏补虚之效，与李中梓止泻之“甘缓法”相合。

前期的临床和实验研究已经证实生姜泻心汤具有降低伊立替康肠毒性的作用，并发现与其抑制肠粘膜细胞凋亡、促进肠干细胞增殖及改变肠道细菌分泌的代谢酶活性相关［19］。本研究运用网络药理学，分析生姜泻心汤的有效成分及作用靶点，为探索生姜泻心汤治疗化疗相关性腹泻的机制研究提供理论基础。

本研究显示，生姜泻心汤的有效成分作用靶点276 个，与CID 相关的作用靶点173 个。木犀草素（luteolin）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）、表儿茶素（ent-Epicatechin）、松柏苷（coniferin）、儿茶素（-）-cate⁃chin、槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempferol）、谷甾醇（sitosterol）等为关键的有效化合物。文献表明木犀草素属于类黄酮类，具有抗炎作用，在调节肠道免疫系统和治疗慢性炎症性肠病中起着重要作用，可以减少小肠内容物的体积和重量，从而发挥止泻作用［18，20］。表儿茶素可以调节K+、Ca2+通道［21］，：表儿茶素可能减少炎症因子TNF-α、IL-1 和IL-6，抑制LPS 诱导的细胞炎症反应，起到抗炎作用［22］。槲皮素能显著降低TLR2 和TLR4 mRNA 和蛋白水平，降低MyD88 蛋白表达水平，进一步降低炎性因子TNF-α 的释放量，保护大鼠肠黏膜微血管内皮细胞免受细胞炎性损害［23］。研究通过网络药理学发现生姜泻心汤可能主要是通过上述化合物发挥治疗CID 的作用。

从蛋白互作网络的结果来看，STAT3、AKT1、MAPK3、JUN、MAPK1、RELA、IL-6、MAPK14、MAPK8、APP、EGFR 等是生姜泻心汤治疗化疗相关性腹泻的关键靶点。研究表明，促炎症细胞因子通过激活STAT3 信号转导通路，引起肠黏膜屏障的受损，导致腹泻发生［24］。炎性因子IL-6 的释放导致肠道细菌移位及内毒素的吸收，加重肠黏膜屏障的损伤，导致腹泻加重［25］。AKT1 是调节免疫、降低炎症、抑制癌症发生的关键信号传导节点［26］。

GO 功能富集分析结果主要与DNA 结合转录因子结合、细胞因子受体结合、脂多糖应答、化学应激反应等生物学过程相关。在靶点基因的KEGG富集分析中，可以发现Toll 样受体信号通路、肿瘤坏死因子（TNF）信号通路、乙型肝炎信号通路高度富集，与CID 密切相关。Toll 样受体是一种模式识别受体，通过识别病原微生物表达的病原相关分子结构激活相关信号通路诱导机体产生免疫反应，从而清除入侵的病原微生物［27，28］。TLR 还可以在肠上皮细胞表面表达，可识别并结合微生物及其代谢产物。目前，在哺乳动物中已经发现了10 多个TLR 家族成员。其中，TLR4 的表达与伊立替康迟发性腹泻的发生密切相关，TLR4 通过促进炎症因子表达、抑制肠上皮TJs 表达而破坏肠道屏障功能［29，30］。TLR4-MyD88 依赖性信号通路的下游可以转导c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal ki⁃nase，JNK）JNK 信号通路主要参与细胞增殖、分化、凋亡的调控。抑制JNK 表达可促进肠上皮TJs的表达并降低肠道通透性［31］。

分子对接采用21 个药物活性成分与10 个靶点进行分子对接，结合能均小于-5 kcal/mol，可形成氢键，筛选出的药物成分和靶点结合性较高，验证了运用网络药理学方法对生姜泻心汤治疗CID 作用机制进行初步探讨的可靠性。

综上所述，本研究利用网络药理学和分子对接相结合的方法，预测生姜泻心汤治疗CID 的作用机制，发现173 个药物与疾病的共同靶点，生姜泻心汤治疗CID 可能是通过STAT3、AKT1、MAPK3、JUN、MAPK1、RELA、IL6 等蛋白作用，发生DNA结合转录因子结合、细胞因子受体结合、脂多糖应答、化学应激反应等生物学过程，并主要富集在Toll样受体信号通路、肿瘤坏死因子（TNF）信号通路、乙型肝炎（hepatitise B）信号通路、A 型流感病毒（in⁃fuenza A）通路、小细胞肺癌相关通路等信号通路上，发挥抗炎和修复屏障等作用。本研究对生姜泻心汤为进一步研究提供了重要参考，对药物作用机理进行了初步探索。但本研究仅作为一种预测，是在分子机制层面进行的预测探讨，根据研究结果中排名靠前的通路，并结合参考文献，展开基础研究进行进一步验证其具体的作用机理。

作者贡献度说明：

高宇：课题实施、撰写全文等工作；贾立群：提出论文主题，设计实施方案，论文终稿审阅；孙建荣：网络药理、分子对接数据分析及整理；邓超：图表整理及文章修改。