基于响应面优化杜仲多糖提取工艺的研究

朱 琳，郝晓亮，徐园园，田晓溪

（辽宁科技大学 化学工程学院，辽宁 鞍山 114051）

杜仲具有利尿、降压、消炎、强身健体的功效，杜仲的叶和皮富含《中国药典》中提到的多化糖合物，具有多种抗氧化成分，因此，杜仲在中药材中用途非常广泛，对于腰膝酸软、畏寒怕冷、高血压、风湿病，尤其是现代社会中，对于各种腰椎疾病、骨质疏松、骨关节疼痛、风湿痹痛，都可以起到很好的治疗效果[1-3]。

多糖在抗癌抗病毒、免疫调节、降血糖等方面有很大的功效。本文先考察单因素乙醇浓度、料液比、提取时间对多糖提取率的影响，结合响应面法优化提取条件，对杜仲多糖的食品研究，医药研究等方面的效益增加有着重要价值[4-5]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

杜仲来源于市售，葡萄糖、苯酚、硫酸等均为分析纯，由辽宁科技大学生物实验室提供。

1.2 仪器与设备

KQ-250B 超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司生产；UV-2000 紫外可见分光光度计，上海分析仪器总厂生产；JM-A1003 电子天平，诸暨市超泽衡器设备有限公司生产；多功能粉碎机，永康市速锋工贸有限公司生产；HH-2恒温水浴锅：金坛市城东新瑞仪器厂生产。

1.3 试验过程

1.3.1 杜仲粉的预处理

将杜仲放入多功能粉碎机内进行粉碎，重复3 次粉碎操作，过滤后置于干燥器中备用。

1.3.2 杜仲多糖提取

精确称量0.5 g预处理后的杜仲粉，以不同浓度的乙醇溶液为提取溶剂，按工艺研究中的不同参数设定提取时间，提取结束后过滤得到杜仲粗多糖，记录过滤后的溶液体积。

1.3.3 多糖含量与提取率的测定

准备2 支10 mL 容量瓶，标号1、2，取杜仲粗多糖1.0 mL于1 号容量瓶中，去离子水定容后超声，取超声后的样液0.125 mL 于2 号容量瓶中，加入0.875 mL 去离子水，超声，去离子水补至2 mL，再次超声。超声后的样液中加入1.0 mL浓度为5%的苯酚，摇匀超声后快速加入5.0 mL的浓硫酸，超声后放入已设定40℃水浴锅中水浴加热15 min，取出后迅速冷却至室温，用2.0 mL 蒸馏水做空白调节透过率，调节在波长490 nm 处使用预热好的分光光度计测定其吸光度，记录，结合其余条件计算提取率。

1.4 杜仲多糖提取试验

1.4.1 单因素试验

将杜仲在粉碎机内粉碎。取杜仲粉末0.5 g 于磨口锥形瓶中，加入配好超声后的乙醇溶液，加入根据设计得出后的料液比，在不同提取时间下提取多糖。试验结束后分别对不同试验得出得吸光度和剩余体积进行计算，得出多糖的提取率，初步确定各个因素的影响程度及较好的提取条件[6-7]。

（1）料液比的筛选。料液比分别设为1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60，提取时间30 min、70%乙醇溶液，得出不同料液比对多糖提取率的影响。

（2）乙醇浓度的筛选。乙醇浓度分别设为50%、60%、70%、80%、90%，在料液比1∶50（选择最优料液比）、超声提取30 min，得出不同乙醇浓度对多糖提取率的影响。

（3）超声提取时间的筛选。超声提取时间分别设为20 min、30 min、40 min、50 min、60 min，在料液比1∶50（选择最优料液比）、乙醇浓度60%（选择最优乙醇浓度），得出不同提取时间对多糖提取率的影响。

1.4.2 多糖含量的测定

多糖含量测定采用苯酚——硫酸法[3]，在490 nm波长处，将浓度（mg/mL）设为横坐标，吸光值为纵坐标，作直线回归，结果见图1。

图1 葡萄糖溶液标准曲线Fig.1 The standard curve of glucose solution

多糖提取率计算公式：

式中：C——由葡萄糖标准曲线计算得到的多糖含量；V——提取液定容体积，mL；W——样品取样质量，g。

1.4.3 单因素试验设计

用料液比1：50，提取时间为30 min，乙醇溶液浓度为60%作为基本条件，改变单因素中的不同水平，比较不同因素条件下对提取液中多糖类化合物的影响并检测杜仲中多糖的提取率的大小。

1.4.4 响应面试验设计

综合单因素试验的结果，使用Design-Expert 8.0.6 软件设计响应面，以多糖提取率作为响应值，对不同乙醇浓度、料液比及提取时间3个因素做出改变，设计3因素3水平的响应面试验[8]。

1.4.5 正交试验

正交试验，见表1。

表1 正交试验表Tab.1 The rthogonal test table

2 试验结果讨论与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 提取时间对杜仲多糖提取率的影响

由图2 知，多糖的提取率随着提取时间的延长呈先增大后减小的趋势，在30 min 左右时，提取已经较为完全。后续提取率的下降可能由于超声仪器长时间工作导致的升温使多糖的内部结构发生改变。

图2 提取时间对多糖提取率的影响Fig.2 The effect of extraction time on polysaccharide extraction rate

2.1.2 料液比对杜仲多糖提取率的影响

由图3 知，料液比的增大，杜仲多糖提取率逐渐增大，当料液比为1∶50时，达到最大，此后有小幅度降低，分析可能由于料液比的增大导致后续过滤的困难。

图3 料液比对多糖提取率的影响Fig.3 The effect of material liquid ratio on polysaccharide extraction rate

2.1.3 乙醇浓度对杜仲多糖提取率的影响

由图4知，当乙醇浓度由50%上升到60%，提取率迅速增大，然后虽然乙醇浓度增加，但提取率呈下降的趋势，可能由于乙醇浓度的增加导致多糖的活性和结构发生变化。

图4 乙醇浓度对多糖提取率的影响Fig.4 The effect of ethanol concentration on polysaccharide extraction rat

2.2 响应面优化提取工艺

响应面的设计与结果见表2。

表2 响应面的设计与结果Tab.2 The design and the results of the response surface

经过多元回归模拟分析，得到杜仲多糖提取率的预测值（Y）对编码1.22A2-0.30B2-0.27C2-0.005AB-0.01AC-0.005B C+0.095A+0.19B-0.085C，对该回归模型进行方差分析，结果见表3。

表3 响应面试验结果的方差分析Tab.3 The variance analysis of the response surface results

由表3 分析可知，模型P＜0.05，上述回归模型差异显著，说明杜仲多糖提取率的拟合方程可靠性很好，在拟合方程一次项A、B、C 中，A 的P值＜0.001，效果极显著，可得出乙醇浓度对多糖的提取率相比于提取时间和料液比对多糖的提取率影响较大。

图7 料液比和乙醇浓度对杜仲多糖提取率的影响Fig.7 Effects of solid liquid ratio and ethanol concentration on extraction rate of Eucommia ulmoides polysaccharide

根据响应面法对提取参数与杜仲多糖提取率之间的关系分析三维响应面图，随着乙醇浓度的增加和液料比的增加，多糖的提取率逐渐增加到一定值时，多糖的提取率开始下降。

图8 提取时间和乙醇浓度对杜仲多糖提取率的影响Fig.8 The effect of extraction time and ethanol concentration on extraction rate of Eucommia ulmoides polysaccharides

随着提取时间和乙醇浓度的增加，多糖的提取率逐渐增加。

图9 提取时间和料液比对杜仲多糖提取率的影响Fig.9 The effect of extraction time and material liquid ratio on extraction rate of Eucommia ulmoides polysaccharides

随着提取时间的增加和料液比的增加，多糖的提取率呈先增大后减小的趋势

3 结论

以单因素试验为基础，进一步进行响应面试验，对提取杜仲中多糖物质进行分析，优化工艺条件最后得出提取率最高的工艺为料液比为1∶60，乙醇浓度60%，提取40 min，多糖的提取率为44.53%。本研究为获得经济、简单、稳定、可行的杜仲多糖提取工艺提供了参考依据，为杜仲多糖的医药、食品等产品的研发提供资料支撑。