黄芩苷抑制糖尿病大鼠心肌成纤维细胞分化机制研究

徐秋玲 郭 冉 王以宁 孙 卫 张绪东 郑学芝▲

1.牡丹江医学院基础医学院，牡丹江黑龙江 157011；2.牡丹江医学院附属第二医院心内科，牡丹江黑龙江 157011

心脏纤维化由驻留的心脏成纤维细胞激活介导，成纤维细胞分化为肌成纤维细胞以应对损伤或压力，肌成纤维细胞的形成是一个对急性损伤的生理反应[1]，研究发现炎症损伤参与糖尿病心肌病病理过程[2]，α-平滑肌细胞肌动蛋白（α-smooth muscle cell actin，α-SMA） 是心肌成纤维细胞分化为肌样成纤维细胞的标志物。 miR-146a 异常表达参与缩窄性心肌炎纤维化病理过程[3]。 在糖尿病心肌纤维化病理过程中microRNA-146a（miR-146a）与α-SMA 表达相关性报道较少。 中药黄芩的活性成分黄芩苷具有抗炎、抗氧化、抗纤维化作用[4]，本课题组前期研究发现黄芩苷参与糖尿病鼠心肌纤维化，本实验主要研究黄芩苷参与糖尿病心肌纤维化与miR-146a 和α-SMA 表达相关性，为糖尿病心肌病的治疗提供理论依据。

1 对象与方法

1.1 实验动物

24 只健康雄性SD 鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司[许可证号：SCXK（京）2016-0006]，饲养于SPF/VAF 级动物室， 室温18～25℃， 相对湿度50%～80%，每日光照12 h，自由摄食、饮水。 适应性饲养1 周后进行实验。动物实验通过牡丹江医学院动物实验伦理委员会审核通过。

1.2 主要仪器与试剂

血糖仪（美国强生公司，20202221732）；荧光定量PCR 仪（美国Invirtogen 公司，A43162）；黄芩苷（Sigma公司，MFCD00134418）；生理盐水配制药液，链脲佐菌素（美国Sigma 公司，MFCD00006607）；qPCR 试剂盒（美国Invirtogen 公司，F455XL）；抗α-SMA 抗体（博士德生物工程有限公司，A03744）；抗GAPDH 抗体（博士德生物工程有限公司，A00227-3）。

1.3 实验分组及处理

用随机区组设计法先将24 例健康雄性SD 鼠从01～24 编号， 在随机数字表中任一位置开始按行选择，选取雄性8 例作为对照组，余16 例建立糖尿病模型：采用尾静脉注射链脲佐菌素45 mg/kg（溶于0.1 mmol/L 枸橼酸缓冲液），72 h 后连续2 次空腹血糖大于或等于16.7 mmol/L 为糖尿病造模成功。 然后将造模成功的鼠再按照随机区组设计法分为模型组和治疗组，每组各8 例。

治疗组普通饲料饲养，同时腹腔注射黄芩苷药液每天每千克15 μmol/L。 对照组和模型组同样普通饲料饲养，同时腹腔注射与黄芩苷等容积的生理盐水，连续用药8 周后， 动物禁食12 h， 用10%水合氯醛（3.5 ml/kg）腹腔麻醉，然后在冰上快速取心脏组织，称重记录，心脏剪成大小约为1 mm3的组织块，加入胰酶心肌细胞消化液，搅拌3 次，每次10 min；3000 g离心，离心半径10 cm，5 min；弃去悬液，加入PBS 重悬细胞；3000 g 离心，离心半径10 cm，5 min；去悬液，PBS 重悬细胞后置于培养瓶中，因心肌细胞较心脏成纤维细胞贴壁速度慢，所以利用差速贴壁法将心肌细胞和心脏成纤维细胞分离，收集心脏的成纤维细胞[5]。

1.4 观察指标及检测方法

1.4.1 基线资料 测各组血糖、心脏重量、体重，计算心脏重量指数（心脏重量/体重）。

1.4.2 RT-PCR 检测miR-146a 表达 提取细胞总RNA，6000 g 离心，离心半径10 cm，5 s。70℃干浴3 min。加逆转录酶0.5 μl，37℃水浴，60 min。 85℃干浴5 min失活处理，进行定量PCR 实验。 miR-146a 正向引物5′-CAGCTGCATTGGATTTACCA-3′，miR-146a 反 向引物5′-GCCTGAGACTCTGCCTTCTG-3′，内参U6 正向引物5′-TACGATACAAGGCTGTTAGAGAG-3′，内参U6 反向引物5′-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3′。qPCR 反应体系：SYBR Green 9 μl，cDNA 2 μl， 正向引物2 μl，反向引物2 μl。反应条件：95℃10 min 预变性，95℃变性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸10 s，40个循环。 用2-△△CT法计算目的基因相对于内参基因的mRNA 相对表达量[6-7]。

1.4.3 Western-blot 检测心肌成纤维细胞 α-SMA、GAPDH 蛋白PBS 冲洗细胞3 次， 加入胰蛋白酶消化细胞，4℃离心弃上清，加入适量细胞裂解液，冰上裂解30 min，4℃，13 000 g，15 min，离心半径10 cm。吸取上清，蛋白定量分装，10 μg/管。 Western-blot 步骤：十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）电泳，转膜；分别加入抗α-SMA 和抗GAPDH抗体孵育（封闭液稀释1∶500），4℃过夜，TBST 洗2次，每次5 min，加入二抗（封闭液稀释1∶1000），室温10 min，TBST 洗3 次，每次5 min。滤膜于显色液中反应1 min。拍照并计算灰度值。

1.5 统计学方法

采用SPSS 22.0 统计学软件进行数据分析， 计量资料用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t 检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组血糖、心脏重量指数的比较

治疗组血糖、心脏重量指数低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）；治疗组血糖、心脏重量指数均高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

表1 三组血糖、心脏重量指数的比较（±s）

表1 三组血糖、心脏重量指数的比较（±s）

注 与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

组别 血糖（mmol/L） 心脏重量指数模型组（n=8）治疗组（n=8）对照组（n=8）24.6±1.01a 11.4±2.12ab 5.60±0.02 0.0038±0.00013a 0.0022±0.00024ab 0.0016±0.00021

2.2 三组miR-146a、α-SMA 的比较

治疗组miR-146a 高于模型组，a-SMA 低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）；治疗组miR-146a 低于对照组，α-SMA 高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）（表2、图1）。 蛋白相对表达水平：α-SMA 灰度值/GAPDH 灰度值。

图1 三组α-SMA 的比较

表2 三组miR-146a、α-SMA 的比较（±s）

表2 三组miR-146a、α-SMA 的比较（±s）

注 与对照组比较，aP＜0.05； 与模型组比较，bP＜0.05；α-SMA：α-平滑肌细胞肌动蛋白；miR-146a：microRNA-146a

组别 miR-146a α-SMA模型组（n=8）治疗组（n=8）对照组（n=8）0.93±0.04a 1.34±0.01ab 1.63±0.02 1.68±0.03a 1.32±0.01ab 0.61±0.04

3 讨论

心肌纤维化是糖尿病心肌病的特征性病理表现[8]。高血糖刺激细胞外基质的合成和沉积，血管代偿性增殖，导致心肌纤维化[9]。本实验使用链脲佐菌素一次性较大剂量静脉注射的给药方法建立与人类1 型糖尿病表现相似的糖尿病模型[10]。

黄芩苷是干燥黄芩根部的生物活性形式，具有抗炎、抗氧化等功效。 研究发现黄芩苷能够减轻氧化应激相关的损伤，减轻炎症反应，黄芩苷通过减少转化生长因子-β1（transforming growth factor beta 1，TGF-β1）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）表达参与博来霉素诱导的肺纤维化[11]。 黄芩苷具有抗炎作用，黄芩苷通过抑制toll 样受体4/核转录因子（toll-like receptors 4/nuclear factor-kappa B，TLR4/NF-κB）信号通路激活来抑制小胶质细胞诱导的神经炎症[12]。 本研究结果显示，模型组血糖高于对照组，差异有统计学意义 （P＜0.05）， 提示糖尿病模型造模成功。模型组与治疗组、治疗组与对照组血糖比较，差异有统计学意义（P＜0.05），提示黄芩苷影响血糖的代谢，具有降低糖尿病鼠血糖的功能；模型组心脏重量指数高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），提示高血糖刺激心肌组织增生，使心肌代偿性肥大，心脏重量增加，与文献报道结果一致[13]。 模型组与治疗组、治疗组与对照组心脏重量指数比较，差异有统计学意义（P＜0.05），提示黄芩苷对心肌有影响，黄芩苷参与糖尿病心肌重构。

microRNAs（miRNAs）是一类非编码小RNA，高度保守，长度21～25 个碱基，miRNAs 通过抑制mRNA翻译、 诱导mRNA 降解来调节基因表达，miRNAs 参与多个靶点上游调控因子的调控[14]。 1 型糖尿病是一种慢性自身免疫性疾病，炎症介质在1 型糖尿病的病变过程中起到重要作用，炎症有助于早期诱导和放大针对胰腺β 细胞的免疫攻击，抑制β 细胞功能，参与β 细胞凋亡[15]。 miR-146a 是miR-146 家族中的成员，参与免疫和炎症反应的反向调节[16-17]。 慢性炎症是糖尿病的病理基础，降低miR-146a 表达，加重炎症[18]。本研究结果显示，模型组miR-146a 表达低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），提示高血糖抑制miR-146a 表达，诱导炎症反应，使细胞外基质的合成及分解代谢紊乱。模型组与治疗组、治疗组与对照组miR-146a 比较，差异有统计学意义（P＜0.05），提示黄芩苷干预心肌炎症反应， 可以改善糖尿病鼠心肌炎性损伤，参与1 型糖尿病心肌炎性变化的病理过程。

心脏成纤维细胞分化为肌样成纤维细胞，是心肌纤维化的关键因素。肌样成纤维细胞收缩力、迁移力和合成胶原能力增强，加剧心肌重构，降低心脏功能[19]，α-SMA 是肌样成纤维细胞的表面标志物， 是成纤维细胞分化为肌样成纤维细胞关键蛋白[20]。 本研究发现模型组α-SMA 高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），提示高血糖刺激下，心肌成纤维细胞向肌样成纤维细胞转化， 加剧糖尿病心肌纤维化的病理进程。模型组与治疗组、治疗组与对照组α-SMA 比较，差异有统计学意义（P＜0.05），提示黄芩苷参与心肌纤维化过程，通过抑制α-SMA 表达抑制心肌成纤维细胞向肌样成纤维细胞转化，抑制糖尿病鼠心肌纤维化，调控心脏重塑过程，对糖尿病心肌具有保护作用。

综上所述， 黄芩苷能够提高糖尿病鼠心肌成纤维细胞中miR-146a 表达， 抑制高糖对心肌炎性伤害；抑制α-SMA 表达，降低糖尿病鼠心肌纤维化的进程， 为运用黄芩苷治疗糖尿病心肌纤维化提供理论依据。