MEBT／MEBO 对慢性难愈合创面 NF⁃κB p65、 IκBα、IKK及其磷酸化蛋白表达水平的影响

田馨如 贺佐分 岑丽君 郭文闻 童丹蕾 黄金梅 葛星月 杨雅量 李文武 唐乾利

慢性难愈合创面是指由各种原因导致的经长时间治疗后仍未愈合也无明显愈合倾向的创面。创疡再生医疗技术由烧伤湿润暴露疗法 （moist exposed burn therapy，MEBT）与湿润烧伤膏 （moist exposed burn ointment，MEBO）发展而来，经临床证实对慢性难愈合创面具有较好的治疗效果［1－4］，且既往研究表明多种炎症因子参与创面愈合过程中炎症反应的发生及发展，而MEBO可通过下调炎症信号转导通路相关因子的表达而促进创面的愈合［5－6］。为进一步证实MEBT／MEBO促进创面愈合的分子生物学作用机制，本研究笔者鉴于核因子κB （nuclear factor⁃κB，NF⁃κB） p65、 NF⁃κB 抑制蛋白 （inhibitor⁃κ binding probein， IκB）、 IκB 激酶 （IκB kinase， IKK） 是经典炎症信号转导通路 IKK／IκB／NF⁃κB 的关键因子［7］，探讨了 MEBT／MEBO对慢性难愈合创面组织中 NF⁃κB p65、 IKK、 IκBα 蛋白 以 及磷酸化（phosphorylation， p） 蛋白 p⁃NF⁃κB p65、 p⁃IKK、p⁃IκBα 表达水平的影响。

1 实验材料

1.1 实验动物

2月龄健康SPF级雄性Wistar大鼠90只，体质量220～250 g，均购自长沙市天勤生物技术有限公司，许可证号SCXK （湘）2014⁃0011。本研究经右江民族医学院实验动物伦理委员会批准。

1.2 主要试剂与设备

湿润烧伤膏：汕头市美宝制药有限公司生产，批号2101603A；重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶：珠海亿胜生物制药有限公司生产，批号04200309；水合氯醛：成都市科隆化学品有限公司生产，批号2021021501；醋酸氢化可的松：山西兆益生物有限公司生产，批号20110102；呋喃西林：上海阿拉丁生化科技股份有限公司生产，CAS号59⁃87⁃0；Masson三色染色试剂盒、RIPA组织细胞裂解液：北京索莱宝科技有限公司生产，货号G1340、R0020；化学发光超敏显色试剂盒、山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗：北京中杉金桥生物技术有限公司生产， 货号 sc⁃2048、 ZB2301、 ZB2305；聚偏二氟乙烯 （polyvinylidene fluoride，PVDF）膜：美国 Millipore公司生产，货号 IPVH00010；p⁃IκBα、 p⁃NF⁃κB p65、 p⁃IKK aβ、 NF⁃κB p65、IκBα、 IKK aβ 一抗： 澳大利亚 Affinity Biosciences公司生产，货号Af2002、Af2006、Af3013、AF5006、AF5002、 AF6014。

低温高速离心机、移液器：德国Eppendorf公司生产，离心机型号centrifuge5417R，移液器规格10、 20、 200、 1000 μl； 超低温冰箱： 日本 Sanyo公司生产，型号MDF⁃U72V；电泳仪：北京六一生物科技有限公司生产，型号DYCZ⁃24DN；半干转膜仪：日本ATTO公司生产，型号WSE⁃4040；全自动化学发光图像分析仪：上海天能科技有限公司生产，型号Tanon1600。

2 方法

2.1 模型制备与分组

大鼠适应性饲养1周后，采用随机数表法将其随机分为空白组、对照组、模型组、MEBO组和贝复新组，每组18只。所有大鼠均于腹腔注射10%水合氯醛3 ml／kg麻醉后，电动剃刀剃去背部毛发，充分暴露背部皮肤，并用直径30 mm图章标记造模面积；对照组、模型组、MEBO组和贝复新组在无菌条件下参照赵京禹等［8］的全层皮肤缺损法和沈氏改良塑料环肉芽肿定量法沿脊椎两侧做2个直径30 mm深达筋膜的开放性全层皮肤缺损创面，建立急性全层皮肤缺损创面模型；继而模型组、MEBO组和贝复新组即刻注射醋酸氢化可的松（8 mg／100 g），建立慢性难愈合创面模型。

2.2 创面处理

空白组大鼠备皮处皮肤、对照组大鼠急性创面、模型组大鼠慢性难愈合创面均于1／5000呋喃西林溶液清洁后，依次覆盖2层生理盐水纱布、2层无菌干纱布，胶布 “丰”形固定；MEBO组大鼠创面于1／5000呋喃西林溶液清洁后，依次覆盖2层MEBO药纱 （0.2 g／cm2）、2层无菌干纱布，胶布 “丰”形固定；贝复新组大鼠创面于1／5000呋喃西林溶液清洁后，依次覆盖2层重组牛碱性成纤维细胞生长因子药纱 （60 U／cm2）、2层无菌干纱布，胶布 “丰”形固定，每天换药2次。

2.3 观察指标

（1）分别于干预第3、7、14天，每组随机选取6只大鼠，在固定焦距下对创面进行拍照，并使用Image J软件测量创面面积，计算创面愈合率。创面愈合率＝ （初始创面面积－时相点创面面积） ／初始创面面积×100%。

（2）分别于干预第3、7、14天，每组随机选取6只大鼠处死，从深筋膜下层切取距离创缘0.5 cm处的创面及创周组织，无张力平展于滤纸上，平分后一半用滤纸包裹置于包埋盒，并放入10%中性缓冲福尔马林溶液中浸泡24 h后，再次浸泡于70%酒精中置于4℃冰箱保存备用；一半置于冻存管中，放入液氮罐－80℃保存备用。

（3）取4℃冰箱保存备用组织，分别进行Masson染色及HE染色后观察组织病理学变化情况。

（4）取－80℃液氮保存备用组织，采用免疫印迹法检测 NF⁃κB p65、 IKK、 IκBα、 p⁃NF⁃κB p65、p⁃IKK、 p⁃IκBα 蛋白表达水平。 用匀浆器将冷冻组织磨碎后，于低温环境中加入组织裂解液，提取总蛋白，并用紫外分光光度计测定总蛋白浓度，绘制蛋白浓度标准曲线；取蛋白上样与聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白上样缓冲液混匀后100℃下加热5 min进行蛋白变性，后置于－20℃冰箱中保存；在聚丙烯酰胺凝胶中加入等体积蛋白上样，100 V恒压电泳、250 mA恒流转膜、封闭后，置于4℃环境下孵育一抗过夜；一抗孵育后，磷酸盐吐温缓冲液（phosphate buffered solution，PBST） 洗膜3次，然后加入二抗，室温下孵育60 min；二抗孵育后，PBST洗膜3次，并曝光显影；最后，使用Image J图像分析软件分析蛋白条带灰度值。

2.4 统计学处理

采用SPSS 22.0统计软件对所得数据进行统计学分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用q检验；均以P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 各组大鼠创面愈合率对比

干预第3、7天，各组大鼠创面愈合率均无明显差异 （P均＞0.05）；干预第14天，模型组大鼠创面愈合率明显低于对照组、MEBO组 （P均＜0.05），其余各组间创面愈合率均无明显差异 （P均＞0.05）， 详见表1、 图1。

图1 不同时间点各组大鼠创面愈合情况对比图Fig.1 Comparison of wound healing condition of rats in each group at different time points

表1 不同时间点各组大鼠创面愈合率对比 （%，±s）Table 1 Comparison of wound healing rate of rats in each group at different time points（%， ±s）

表1 不同时间点各组大鼠创面愈合率对比 （%，±s）Table 1 Comparison of wound healing rate of rats in each group at different time points（%， ±s）

注：MEBO为湿润烧伤膏；对照组与模型组大鼠创面采用生理盐水纱布换药处理，MEBO组大鼠创面采用MEBO换药处理，贝复新组大鼠创面采用重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶换药处理。各组大鼠创面愈合率组间两两对比，与对照组对比，aP＜0.05，差异具有统计学意义；与模型组对比，bP＜0.05，差异具有统计学意义Note： MEBO －moist exposed burn ointment； The wounds of rats in control group and model group were treated with dressing change with normal saline gauze， while the rat wounds in MEBO group and rb⁃bFGF group were respectively treated with dressing change with MEBO gauze and recombinant bovine basic fibroblast growth factor（rb⁃bFGF） gel.The wound healing rate in each group were compared in pairs， and the differences were statistically significant as compared with the control group（aP＜0.05），and with the model group（bP＜0.05）

组别Group只数Number of rats第3天Day 3第7天Day 7第14天Day 14对照组Control group 6 0.31±0.03 0.79±0.02 0.97±0.02模型组Model group 6 0.22±0.05 0.74±0.05 0.86±0.07a MEBO组MEBO group 6 0.26±0.10 0.77±0.04 0.95±0.02b贝复新组rb⁃bFGF group 6 0.24±0.04 0.74±0.02 0.92±0.02 F值F value 2.387 2.939 9.049 P值P value 0.099 0.058 0.001

3.2 各组大鼠皮肤／创面组织病理学观察

Masson染色病理组织学观察结果显示，干预第3天，模型组、MEBO组、贝复新组大鼠创面组织中均可见少量胶原纤维；干预第7、14天，模型组、MEBO组、贝复新组大鼠创面组织中胶原纤维量均明显增加，且MEBO组、贝复新组胶原纤维量明显多于模型组，详见图2。

图2 不同时间点各组大鼠皮肤／创面组织Masson染色图 （×100）Fig.2 Masson staining of rat skin／wound tissues in each group at different time points （ ×100）

HE染色病理组织学观察结果显示，干预第3天，对照组、模型组、MEBO组和贝复新组大鼠创面组织中均可见大量炎症细胞浸润；干预第7天，对照组、MEBO组、贝复新组大鼠创面组织中炎症细胞均明显减少，且可见大量成纤维细胞和新生毛细血管及少量毛囊结构，而模型组大鼠创面组织中仍存在大量炎症细胞，且成纤维细胞和新生毛细血管较少；干预第14天，对照组、MEBO组、贝复新组大鼠创面组织中均可见整齐排列的毛细血管及成熟的毛囊、皮脂腺等，而模型组大鼠创面组织中仍可见少量炎症细胞浸润，但已有大量成纤维细胞生成，详见图3。

图3 不同时间点各组大鼠皮肤／创面组织HE染色图 （×200）Fig.3 HE staining of rat skin／wound tissues in each group at different time points （ ×200）

3.3 各组大鼠皮肤／创面组织中NF⁃κB p65、 IKK、IκBα、 p⁃NF⁃κB p65、 p⁃IKK、 p⁃IκBα 蛋白表达水平对比

干预第7、14天，空白组、对照组、MEBO组大鼠创面组织中NF⁃κB p65、IKK蛋白表达水平均明显低于模型组 （P均 ＜0.05）；干预第7天，MEBO 组大鼠创面组织中NF⁃κB p65、 IκBα 蛋白表达水平均明显高于贝复新组 （P均＜0.05），IKK蛋白表达水平明显低于贝复新组 （P＜0.05）；干预第14天，MEBO组大鼠创面组织中 IKK、IκBα蛋白表达水平均明显低于贝复新组 （P均＜0.05）；其余各组间 NF⁃κB p65、 IKK、 IκBα 蛋白表达水平未见明显规律，详见表2、图4。

表2 不同时间点各组大鼠皮肤／创面组织中NF⁃κB p65、IKK、IκBα蛋白表达水平对比 （±s）Table 2 Comparison of expression levels of NF⁃κB p65， IKK and IκBα in skin or wound tissues of rats in each group at different time points（±s）

表2 不同时间点各组大鼠皮肤／创面组织中NF⁃κB p65、IKK、IκBα蛋白表达水平对比 （±s）Table 2 Comparison of expression levels of NF⁃κB p65， IKK and IκBα in skin or wound tissues of rats in each group at different time points（±s）

注：MEBO为湿润烧伤膏，NF⁃κB为核因子κB，IκB为NF⁃κB抑制蛋白，IKK为IκB激酶；空白组、对照组与模型组大鼠皮肤／创面采用生理盐水纱布换药处理，MEBO组大鼠创面采用MEBO换药处理，贝复新组大鼠创面采用重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶换药处理。各组大鼠皮肤／创面组织中NF⁃κB p65、IKK、IκBα蛋白表达水平组间两两对比，与空白组对比，aP＜0.05，差异具有统计学意义；与对照组对比，bP＜0.05，差异具有统计学意义；与模型组对比，cP＜0.05，差异具有统计学意义；与MEBO组对比，dP＜0.05，差异具有统计学意义Note： MEBO － moist exposed burn ointment， NF⁃κB － nuclear factor⁃κB， IκB － inhibitor⁃κ binding protein， IKK － IκB kinase； The skin or wounds of rats in blank group， control group and model group were treated with dressing change with normal saline gauze， while the rat wounds in MEBO group and rb⁃bFGF group were respectively treated with dressing change with MEBO gauze and recombinant bovine basic fibroblast growth factor（rb⁃bFGF） gel.The expression levels of NF⁃κB p65， IKK， and IκBα in rat skin or wound tissues in each group were compared in pairs， and the differences were statistically significant as compared with the blank group（aP＜0.05），with the control group（bP＜0.05），with the model group（cP＜0.05），and with the MEBO group（dP ＜0.05）

组别Group只数Number of rats NF⁃κB p65IKK IκBα第3天Day 3第7天Day 7第14天Day 14第3天Day 3第7天Day 7第14天Day 14第3天Day 3第7天Day 7第14天Day 14 Blank group 6 0.57±0.03空白组0.61±0.03 0.63±0.01 0.85±0.04 0.93±0.02 1.00±0.01 0.73±0.04 0.80±0.03 0.80±0.03 Control group 6 0.57±0.01对照组0.62±0.01 0.58±0.04 0.79±0.03a 0.76±0.02a 1.05±0.03 0.68±0.01a 0.69±0.01a Model group 6 0.64±0.03ab 0.60±0.04abc贝复新组0.67±0.03ab 0.75±0.01模型组0.69±0.01ab 0.96±0.01ab 0.96±0.02ab 1.23±0.08ab 0.75±0.01b 0.75±0.1ab MEBO Group 6 0.59±0.01c 0.72±0.03a MEBO组0.60±0.02c 0.55±0.04ac 0.79±0.02ac 0.89±0.01abc 0.84±0.05abc 0.74±0.01b 0.69±0.04ac rb⁃bFGF group 6 0.60 ±0.01c 0.68±0.03abd F值F value 11.857 20.560 18.180 59.806 113.471 47.489 11.550 45.210 38.860 0.55±0.02abcd 0.58±0.04c 0.93±0.01abcd 0.94±0.02bd 0.99±0.05cd 0.74±0.01b 0.63±0.01abcd P值P value ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

干预第7、14天，空白组、对照组、MEBO组、 贝复 新 组 大 鼠 创 面 组 织 中 p⁃NF⁃κB p65、p⁃IKK、 p⁃IκBα 蛋白表达水平均明显低于模型组（P均＜0.05），对照组、MEBO组、贝复新组大鼠创面组织中 p⁃NF⁃κB p65、 p⁃IKK、 p⁃IκBα 蛋白表达水平均明显高于空白组 （P均＜0.05）；干预第7 天， MEBO 组大鼠创面组织中 p⁃NF⁃κB p65、p⁃IKK、 p⁃IκBα 蛋白表达水平均明显低于贝复新组（P 均 ＜0.05）； 其余各组间 p⁃NF⁃κB p65、 p⁃IKK、p⁃IκBα蛋白表达水平未见明显规律，详见表3、图4。

图4 不同时间点各组大鼠皮肤／创面组织中 NF⁃κB p65、 IKK、 IκBα 及 p⁃NF⁃κB p65、 p⁃IKK、 p⁃IκBα蛋白表达水平条带图Fig.4 Bar chart of expression levels of NF⁃κB p65， IKK， IκBα and p⁃NF⁃κB p65， p⁃IKK， p⁃IκBα in skin or wound tissues of rats in each group at different time points

表3 不同时间点各组大鼠皮肤／创面组织中 p⁃NF⁃κB p65、 p⁃IKK、 p⁃IκBα蛋白表达水平对比 （±s）Table 3 Comparison of expression levels of p⁃NF⁃κB p65， p⁃IKK and p⁃IκBα in skin or wound tissues of rats in each group at different time points（±s）

表3 不同时间点各组大鼠皮肤／创面组织中 p⁃NF⁃κB p65、 p⁃IKK、 p⁃IκBα蛋白表达水平对比 （±s）Table 3 Comparison of expression levels of p⁃NF⁃κB p65， p⁃IKK and p⁃IκBα in skin or wound tissues of rats in each group at different time points（±s）

注： MEBO为湿润烧伤膏， p⁃NF⁃κB为磷酸化核因子κB， p⁃IκB为磷酸化NF⁃κB抑制蛋白， p⁃IKK为磷酸化IκB激酶； 空白组、 对照组与模型组大鼠皮肤／创面采用生理盐水纱布换药处理，MEBO组大鼠创面采用MEBO换药处理，贝复新组大鼠创面采用重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶换药处理。各组大鼠皮肤／创面组织中p⁃NF⁃κB p65、p⁃IKK、p⁃IκBα蛋白表达水平组间两两对比，与空白组对比，aP＜0.05，差异具有统计学意义；与对照组对比，bP＜0.05，差异具有统计学意义；与模型组对比，cP＜0.05，差异具有统计学意义；与MEBO组对比，dP＜0.05，差异具有统计学意义Note： MEBO － moist exposed burn ointment， p⁃NF⁃κB － phosphorylation nuclear factor⁃κB， p⁃IκB － phosphorylation inhibitor⁃κ binding protein，p⁃IKK － phosphorylation IκB kinase； The skin or wounds of rats in blank group， control group and model group were treated with dressing change with nor⁃mal saline gauze， while the rat wounds in MEBO group and rb⁃bFGF group were respectively treated with dressing change with MEBO gauze and recombi⁃nant bovine basic fibroblast growth factor （rb⁃bFGF） gel.The expression levels of p⁃NF⁃κB p65， p⁃IKK and p⁃IκBα in rat skin or wound tissues in each group were compared in pairs，and the differences were statistically significant as compared with the blank group （aP ＜0.05）， with the control group（bP＜0.05），with the model group（cP＜0.05），and with the MEBO group（dP＜0.05）

组别Group只数Number of rats p⁃NF⁃κB p65p⁃IKK p⁃IκBα第3天Day 3第7天Day 7第14天Day 14第3天Day 3第7天Day 7第14天Day 14第3天Day 3第7天Day 7第14天Day 14 Blank group 6 0.18±0.03空白组0.21±0.02 0.18±0.02 0.45±0.01 0.47±0.04 0.45±0.03 0.29±0.01 0.21±0.03 0.29±0.03 Control group 6 0.40±0.09a 0.59±0.01a对照组0.39±0.02a 0.62±0.01a 0.94±0.03a 0.70±0.06a 0.55±0.03a 0.90±0.02a Model group 6 0.52±0.15a 0.65±0.02ac贝复新组0.81±0.01ab 0.60±0.03a模型组0.88±0.04ab 0.74±0.02ab 1.21±0.04ab 1.26±0.08ab 0.66±0.03ab 1.00±0.03ab MEBO Group 6 0.38±0.09a 1.16±0.06ab MEBO组0.52±0.01abc 0.42±0.03ac 0.66±0.02abc 0.86±0.02abc 0.71±0.03ac 0.52±0.03ac 0.72±0.03abc rb⁃bFGF group 6 0.40 ±0.11a 0.65±0.03ac F值F value 8.750 1376.455 477.143 352.600 441.700 184.930 206.172 517.661 436.800 0.68±0.02abcd 0.38±0.03ac 0.71±0.01abcd 0.97±0.02acd 0.73±0.05ac 0.60±0.01abcd 0.85±0.05acd P值P value ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

4 讨论

慢性难愈合创面是各种因素导致皮肤完整性遭到破坏引起的局部组织损伤经长时间治疗后仍未愈合也无明显愈合倾向的创面，且受损的皮肤或黏膜组织还可引发全身病理生理性改变。既往有研究表明， 炎症信号转导通路 IKK／IκB／NF⁃κB 调节的炎症反应可参与创面的愈合过程，且部分药物可影响NF⁃κB p65、 IKK、 IκBα 及 p⁃NF⁃κB p65、 p⁃IKK、p⁃IκBα 的表达水平［9－10］。

NF⁃κB几乎存在于所有动物细胞中，参与细胞应激反应。 NF⁃κB p65作为 NF⁃κB家族成员之一，翻译修饰后可调节 IKK／IκB／NF⁃κB 信号转导通路活性，进而调节多种基因的表达，并启动其靶基因转录，参与机体炎症反应和自身免疫反应［11］。相关研究显示， 慢性难愈合创面患者体内 IKK／IκB／NF⁃κB信号转导通路持续异常激活，可促使多种促炎因子、细胞因子、生长因子表达，进而引发持续性细胞损伤和功能紊乱，影响创面的愈合进程［12］。正常组织细胞中，NF⁃κB与其抑制物IκB结合构成的NF⁃κB p65／p50 抑制蛋白激酶 IκB 二聚体复合物经泛素降解后，IκB从二聚体上解聚，NF⁃κB p65被释放进入细胞核启动靶基因的表达［13－15］。 IκBα 作为 IKK／IκB／NF⁃κB 信号转导通路的反应因子， 其水平降低可抑制 IKK／IκB／NF⁃κB 信号转导通路活性， 且 NF⁃κB p65 表达水平也随之降低［16－17］。 IKK作为 IKK／IκB／NF⁃κB 信号转导通路的激活物， 可促使 NF⁃κB／IκBα 二聚体蛋白向 p⁃NF⁃κB、 p⁃IκBα转化［18－20］， 机体受到刺激后， IKK／IκB／NF⁃κB信号转导通路中的 IκBα在 IKK的作用下被磷酸化［12，21］。 本研究结果显示， 干预第7、 14天模型组大鼠创面组织中 NF⁃κB p65、 IKK、 p⁃NF⁃κB p65、p⁃IKK、 p⁃IκBα 蛋白表达水平均明显高于空白组及对照组。 可见， IKK／IκB／NF⁃κB 信号转导通路被激活可能是慢性难愈合创面迁延不愈的机制之一。

MEBT／MEBO虽是慢性难愈合创面的有效治疗方法， 但目前尚无 MEBT／MEBO 对 IKK／IκB／NF⁃κB信号转导通路影响的相关研究。本研究结果显示，干预第14天MEBO组大鼠创面愈合率明显高于模型组，干预第7、14天 MEBO组大鼠创面组织中NF⁃κB p65、 IKK、 p⁃NF⁃κB p65、 p⁃IKK、 p⁃IκBα蛋白表达水平均明显低于模型组。创面形成后，IKK蛋白表达水平明显升高，进而促进NF⁃κB二聚体蛋白降解， 激活 IKK／IκB／NF⁃κB 信号转导通路，影响创面愈合，而MEBT／MEBO可能通过其药理作用抑制IKK蛋白的表达，进而降低IκBα、NF⁃κB p65含量，抑制炎症反应，促进创面的再生修复。且研究结果显示，干预第7天MEBO组大鼠创面组织中IKK、 p⁃NF⁃κB p65、 p⁃IKK、 p⁃IκBα蛋白表达水平均明显低于贝复新组。可见，与贝复新相比，MEBO的作用更显著。

综上所述， MEBT／MEBO 可能通过降低NF⁃κB p65、IKK、 p⁃NF⁃κB p65、 p⁃IKK、 p⁃IκBα 蛋白表 达水平， 下调 IKK／IκB／NF⁃κB 信号转导通路活性而促进创面愈合。