川、渝、黔地区猪圆环病毒3型PCR检测及全基因组序列分析

杨晓伟,赵自亮，付 雨，涂少宇，刘 霞，李照伟，浦同灿，王 慧，曾 红，赵光伟* (.西南大学 动物医学院，重庆 荣昌 40460；.贵州省动物疫病预防控制中心，贵州 贵阳 550008；.贵州省花溪区动物疫病预防控制中心，贵州 贵阳 550008)

猪圆环病毒(porcine circovirus，PCV)属于圆环病毒科、圆环病毒属，为单股环状DNA病毒，是兽医学上迄今发现的己知动物病毒中最小的病毒[1]。根据其抗原性和基因组特性目前可分为PCV1、PCV2和新出现的PCV3以及PCV4[2-4]，其中PCV1无致病性，PCV2能引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)和猪皮炎肾病综合征(PDNS)，被广为周知，而PCV3和PCV4近几年才被报道，在2016年，PCV3首次被发现于美国密苏里州、明尼苏达州和南达科他州患有心肌炎、呼吸系统和神经系统疾病的仔猪中[3]，PCV4则是被我国学者于2019年从湖南省临床出现呼吸道疾病、肠道疾病和PDNS的猪群中首次发现[4]。由此，PCV的复杂性引起了国内众多学者的广泛关注。

PCV3基因组全长2 000 bp，GC含量为50%，包含3个开放阅读框(ORF)，ORF1编码衣壳(capsid,Cap)蛋白，ORF2 编码复制(replication,REP)相关蛋白，ORF3编码的蛋白的功能还不清楚。尽管该病毒多报道于患有呼吸道、繁殖障碍、消化道疾病的猪上，但由于毒株分离困难，对其致病性的研究并不多。最新的资料显示汪孟航[5]利用PK-15细胞成功分离到1株PCV3，用其感染3周龄剖宫产仔猪，证实了PCV3具有广泛的组织嗜性，但仔猪并不表现明显的临床症状，因此仍需加强对PCV3的研究。川、黔、渝3省(市)是我国西南地区生猪养殖的重要区域，尤其四川省，2020年国家统计局统计数据显示该省生猪出栏量为5 614.4万头，居全国之首，因此进一步了解该地区PCV3的感染情况及其毒株的分子特征，可为该病毒的后续研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1样本信息 临床样本来源于2020年1月至2021年1月期间四川宜宾、泸州、资阳、内江、自贡、达州、隆昌、叙永、简阳9个地区共145份样本；贵州播州、玉屏、松桃、赤水、贞丰、独山、威宁和花溪8个地区共293份样本；重庆涪陵、石柱、永川、江津、云阳、梁平、忠县、潼南、长寿、合川、巫溪、彭水和云阳13个地区共201份样本。其中四川和重庆地区为临床患病样本，发病症状不尽相同，主要包括发烧、呼吸道症状、繁殖障碍等，多为中小规模养殖场(基础母猪存栏量50～500头)；贵州样本均为表观无临床症状，均为规模化猪场(基础母猪存栏量500头以上)。样本类型包括血清、脾、淋巴结和扁桃体，保存于-80℃。

1.1.2主要试剂 Easy Pure Viral DNA/RNA Kit(ER201-02)购自北京全式金生物公司；DL2000 DNA Marker、胶回收试剂盒、rTaq聚合酶预混液等为TaKaRa公司产品。

1.2 方法

1.2.1引物设计与合成 参考PALINSKI等[3]的文献报道合成PCV3检测所用引物(PCV3-Cap)，参考文献[6]合成PCV3全基因组测序引物(PCV3-Full-1,2,3)，引物序列见表1，由华大基因科技有限公司合成。

表1 引物序列及相关信息

1.2.2核酸的提取 按Easy Pure Viral DNA/RNA Kit试剂盒的说明提取所有样本的DNA，-20℃ 保存备用。

1.2.3PCR扩增条件 PCV3检测反应体系25 μL：2× rTaq PCR Mix 12.5 μL，ddH2O 7.5 μL，PCV3-CAP上下游引物各1.5 μL，样本DNA模板2 μL。反应条件：94℃预变性3 min；94℃变性20 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35个循环；72℃延伸10 min。

PCV3全基因组扩增反应体系50 μL：2× rTaq PCR Mix 25 μL，ddH2O 15 μL，PCV3-Full-1,2,3上、下游引物各3 μL，样本DNA模板4 μL。反应条件：98℃预变性5 min；98℃变性30 s,55℃退火60 s，共30个循环；72℃延伸2 min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，通过Vilber Lourmat Quantum-ST5 成像系统拍照。利用胶回收试剂盒纯化阳性PCR产物后送华大基因科技有限公司进行测序。

1.2.4序列分析及比对 利用DNAstar 7.0和SeqMan软件对测序结果进行分析和拼接，拼接后的全基因组序列通过NCBI网站中BankIt通道上传至GenBank数据库，利用DNAStar软件对序列进行同源性比对，利用Mega 7.0软件对本试验中PCV3全基因组序列、Cap蛋白序列与国内外PCV3株以及PCV2、PCV4毒株进行遗传进化分析，运用Neighbor-Joining方法构建进化树。本试验中所使用的毒株序列等信息见表2。

表2 本试验所用毒株信息

2 结果

2.1 川渝黔地区PCV3检测结果检测结果(表3)显示，四川省9个地区145份样本中阳性样本2份，均来自达州某养殖场，阳性率1.38%(2/145)；重庆13个地区201份样本中共检测到阳性样本4份，阳性率1.99%(2/201)，其中涪陵、云阳地区各2份阳性样本均来源于不同的养殖场；贵州8个地区293份样本中仅在花溪猪场检测到阳性样本1份，阳性率0.34%(1/293)。本次3个省(市)共检测639份样本，阳性样本7份，整体阳性率1.10%，阳性样本的PCR检测结果见图1。

M.DL2000 DNA Marker；1～2.重庆涪陵样本；3～4.重庆云阳样本；5～6.四川达州样本；7.贵州花溪样本图1 PCV3阳性样本PCR扩增结果

表3 川、渝、黔地区PCV3检测结果 份

2.2 PCV3全基因组扩增结果对重庆云阳(2份)、涪陵(1份)、四川达州(1份)和贵州花溪(1份)共5份阳性样本分3个片段进行全基因组序列的扩增，结果如图2A～C所示。

A，B，C分别为5份样本PCV3 3个片段扩增结果，目的片段分别为1 072，425，1 007 bp(M.DL2000 DNA Marker；1～2.重庆云阳样本；3.重庆涪陵样本；4.四川达州样本；5.贵州花溪样本)图2 PCV3全基因组扩增结果

2.3 PCV3全基因组的组装与同源性分析测序拼接结果显示，5株PCV3全基因组均为2 000 bp，按照样本检出地将其分别命名为Chongqing-YY1、Chongqing-YY2、Chongqing FL、Sichuan-DZ 和

Guizhou-GYHX(登录号分别为：OK334614～OK334618)，与NCBI数据库中最早报道的美国PCV3 29160株(登录号：KT869077)相比其同源性为98.8%～99.2%；与国内其他省市毒株同源性为98.2%～99.2%；与PCV2代表毒株相比，同源性较低，仅为44.9%～45.5%；而与最新报道的PCV4 毒株的同源性为46.3%～46.9%(图3)。

图3 5株PCV3全基因组序列与国内外参考毒株同源性比较

2.4 PCV3全基因组及Cap蛋白的遗传进化分析将获得的PCV3基因组序列与国内外已发表毒株进行遗传特性及亲缘关系分析，通过Mega7.0软件绘制进化树(图4)，结果发现重庆云阳2株(Chongqing-YY1，Chongqing-YY2)和涪陵(Chongqing FL)

为本试验所获得的5个PCV3全基因组序列；为GenBank中登记的川、渝、黔毒株；为美国最早报道的PCV3毒株f图4 5株PCV3全基因组序列与参考毒株的系统进化树

PCV3与PCV3-Sichuan-2020(MZ449244)位列同一支，具有较高的亲缘关系。本试验中四川达州地区毒株Sichuan-DZ与2016年湖北地区毒株PCV 3 Hubei-618(KY354039)具有较高的亲缘；贵州花溪样本与2016年广东(KY418606)、广西(MG250179)样本亲缘关系较为密切。与相同省份样本(KY075990、MZ449244、MZ449237)的比对结果显示，重庆、四川、贵州样本均未与之前报道的序列位于一支。同时，5份样本与PCV2和PCV4均处于不同进化分支，亲缘关系较远。

PCV3基因组中编码Cap蛋白的核苷酸存在一致性变异，是进行基因型分类的标准[7]，因此本试验对PCV3毒株编码Cap蛋白的氨基酸序列进行了对比(图5A)以及系统进化树的绘制(图5B)。结果发现，重庆地区的3个毒株(Chongqing-YY1，Chongqing-YY2，Chongqing FL)和四川达州地区毒株(Sichuan-DZ)均为24A(丙氨酸)/27R(精氨酸)，基因型为PCV3a，与美国29160株(KT869077)、湖北地区Hubei-618株(KY354039)、四川地区(MZ449244)和山东地区(KY778776)毒株同属3a基因型，具有较近的亲缘关系；贵州花溪毒株(Guizhou-GYHX)为24L(亮氨酸)/27K(赖氨酸)，属于一种新的变异基因型，按照现有的分类标准不能准确分型。

A．5株PCV3 Cap蛋白与参考毒株氨基酸序列对比结果 B．基于PCV3 Cap序列构建的系统进化树。为本试验所获得的5株PCV3 Cap蛋白序列图5 PCV3 Cap蛋白氨基酸序列比对及遗传进化树

3 讨论

PCV3是一种近几年新发现的病毒，但研究表明其与猪皮炎肾病综合征、繁殖障碍和多系统衰竭综合征等密切相关，在不同年龄阶段的猪组织、血样以及粪便样本中均有检出[7]。该病毒于2016年首次在美国患病仔猪中发现，而后在其他多个国家被检出，我国也相继出现[8-9]。尽管目前PCV3的致病性研究尚未得到充分证实，但由于该病毒常与其他病原混合感染，给养殖业带来极大的潜在威胁。本试验共检测了3个省(市)639份样本，阳性样本7份，整体阳性率1.10%，这与张邑帆等[10]报道的2020年重庆地区PCV3 3.1%的阳性率较接近，但与孙明等[11]报道的2016-2017年间北京地区30.1% 的阳性率有较大差别。分析其原因可能有以下几点：首先是样本的类型不同，本试验中所检测的样本以血清为主，组织病料的样本数量相对较少，不同类型样本的病毒载量不同有可能是造成本试验阳性率低的原因，而阳性率较高的报道中均采用的是组织病料，包括淋巴结、肺、脾和肾等；其次，样本采集策略不同，本试验并未针对有特定临床表现的猪进行样本的采集，而其他研究中的样本均采集自患繁殖障碍和严重呼吸道疾病的猪，推测这或许是造成阳性率差异的主要原因；最后，养殖规模、管理方式以及不同的时空区域等都有可能是造成阳性率差异的原因。

本试验获得3省市共5株PCV3的全基因组，大小均为2 000 bp，5株病毒之间同源性为98.7%～99.9%，与其他省份以及国外毒株的同源性为98.2%～99.2%，说明PCV3的序列较为保守，这与季程远等[12]报道一致。与临床常见的PCV2毒株相比，两者的同源性较低，仅为44.9%～45.5%，与最新报道的PCV4 毒株的同源性也不高，为46.3%～46.9%，因此推断PCV2、PCV3和PCV4之间的交叉保护性会很差或者不存在，由于PCV3和PCV4均为新发病原且都难于分离，因而尚均缺乏详细的研究数据。

根据之前的报道[13-14]，PCV3 基因组中Cap基因是最容易变异的区域，也是受宿主免疫压力选择影响最大的区域，因此基于PCV3 Cap蛋白第24位和27位氨基酸的一致性差异，将PCV3的基因型分为3种，即PCV3a、PCV3b和PCV3c。PCV3a Cap蛋白第24位和第27位氨基酸位点为丙氨酸(A)和精氨酸(R)，PCV3b相应的2个位点分别是丙氨酸(A)和赖氨酸(K)，PCV3c相应的2个位点则是缬氨酸(V)和赖氨酸(K)。本试验获得的5株PCV3中重庆地区的3株均为PCV3a，而在此之前重庆地区最早发现的毒株(KY075990)为PCV3c，说明该病毒在此地区的流行基因型复杂。而本试验鉴定的四川地区毒株与2020年报道的四川毒株(MZ449244)一致，均为PCV3a。值得注意的是本试验中贵州地区毒株Cap蛋白的24和27位氨基酸分别为亮氨酸(L)和赖氨酸(K)，GenBank数据库中尚未发现有类似突变的毒株，以现有的分型标准不能准确判断其基因型，该样本来自于贵州花溪地区一无临床表现的猪血清样本，目前尚不清楚其突变意义，需进一步深入研究。

本试验结果也暴露出目前尚无绝对完善的PCV3基因分型方案，对其分型方法的标准仍有待于进一步研究，此外由于目前所发现的PCV3全基因组数量仍较少，且未见基因型与致病性相关联的研究报道，已有学者针对现行的PCV3分型方法提出了是否具有必要性和现实意义的疑问[14]，因此对毒株进行分离以及致病性等基础研究应是将来的重点研究方向。

综上，本试验获得了四川、重庆和贵州3省市PCV3感染情况的一手资料，对不同省份PCV3毒株的全基因组进行了测定和分析，其结果对了解PCV3的遗传变异和地方流行病学特征提供了数据参考。