基于网络药理学的当归-红花治疗原发性痛经的作用机制

刘 嘉，严宝飞，孙占东，张天宇，曾庆琪,3

(1.江苏卫生健康职业学院 药学院，江苏 南京 211800；2.南京中医药大学 第一临床学院，江苏 南京 210046；3.江苏省中医院 男科，江苏 南京 210029)

痛经为最常见的妇科症状之一，主要表现为月经期痉挛性疼痛，严重者可因疼痛而晕厥。痛经分为原发性痛经和继发性痛经，其中原发性痛经占患者人数的一半以上[1]。现代医学认为：原发性痛经主要为子宫收缩不良，进而导致子宫缺血、缺氧，经血流出不畅，同时可能伴随前列腺素(PG)、血管加压素(AVP)、催产素(OT)、钙离子(Ca2+)等分泌异常[2]，最终表现为经期或经期前后小腹疼痛等症状。现代西医治疗包括药物治疗和手术治疗，其中又以药物治疗为主。中医谓痛经为：“经行腹痛，证有虚实，实者或因寒滞，或因血滞，或因热滞，虚者或因血虚，或因气虚”，认为痛经病机主要为气血运行不畅导致的“不通则痛”，胞宫失却濡养导致“不荣则痛”[3]。与西药治疗相比，中药不仅能达到止痛之效，更能发挥中医辨证论治，起到标本兼顾的效果[4]，故研究与开发防治原发性痛经的中药具有重要意义。

当归为伞形科植物当归Angelicasinensis(Oliv.)Diels的干燥根，其味甘辛，温通而和血活血、行瘀消肿、调经止痛；红花为菊科植物红花CarthamustinctoriusL.的干燥花，味辛，善走心肝二经，入血能活血通经、祛瘀止痛。二者合用则具有补血活血、祛瘀通络以及痛经止痛之功效，被应用于《伤寒大白》之当归红花汤，《麻科活人》之当归红花饮，《医宗金鉴》之桃红四物汤，《医林改错》之血府逐瘀汤等[5]，已为中医妇科常用药对。现代临床将其用于血瘀或血虚之痛经、闭经和月经不调等症[6]。

中药及其组方往往含有多种类型的化学成分，且成分之间互相影响，共同作用于多个途径、多个环节和靶点，最终形成独特的中医临床功效。网络药理学是融合分子生物学、药理学等多种学科的网络平台，通过构建药物—成分—靶点—疾病的整体网络，全面系统地反映中药及其组方治疗疾病的作用机制，从而契合祖国医学的整体治疗观[7]。尽管已有文献报道桃红四物汤、四物汤治疗原发性痛经的网络药理学研究，但尚无当归-红花药对治疗原发性痛经的网络药理学报道。与以往文献相比，本研究以当归-红花药对为切入点，拟从网络药理学角度探讨当归-红花药对治疗原发性痛经的潜在活性成分和可能的作用机制，并揭示其配伍的科学内涵。通过对当归-红花药对治疗原发性痛经的网络药理学研究，不仅有助于解析当归-红花药对在桃花四物汤、补阳还五汤等中药复方中的作用，更有利于指导其临床科学用药，提高临床治疗效果，对于揭示含当归-红花药对复方制剂的配伍理论有着重要意义。

1 材料与方法

1.1 当归-红花药对中目标化学成分的选取

以课题组前期对当归、红花功效物质基础研究，结合国内外关于当归、红花药效及质量控制相关文献，选取当归、红花中25个化学成分为研究对象，详见表1。

表1 当归-红花中25个化学成分的信息Table 1 Information of 25 compounds in ASR-CF

1.2 化学成分作用靶点的获取

将以上25个化学成分的名称作为关键词导入TCMSP数据库(http:∥tcmspw.com/tcmsp.php中药系统药理学技术平台)、SwissTargetPrediction数据库(http:∥www.swisstargetprediction.ch/)、BindingDB数据库(http:∥www.bindingdb.org/)、PharmMapper数据库(http:∥www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)和BATMAN-TCM数据库(http:∥bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)，获得当归-红花上述成分的作用靶点。同时比对UniPort数据库(https:∥uniport.org/)，选择作用靶点的标准名称，并建立目标成分的潜在作用靶点库。

1.3 原发性痛经靶点的筛选

将primary dysmenorrhea、primary dysmenorrheal和essential dysmenorrhea作为关键词导入GeneCards数据库(http:∥www.genecards.org/)、NCBI数据库(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov)、TTD数据库(http:∥db.idrblab.net/ttd/)、CTD数据库(http:∥ctdbase.org/)和OMIM数据库(https:∥omim.org/)中，其中NCBI中设置物种为Homo sapiens，以检索原发性痛经疾病相关靶点基因。将当归-红花中目标成分潜在作用靶点与原发性痛经靶点基因导入Venny 2.1绘图软件中取交集，获取当归-红花化学成分潜在的治疗原发性痛经的靶点。

1.4 药物—成分—靶点—疾病整体网络的建立

利用Cytoscape 3.7.0软件对当归-红花治疗原发性痛经潜在靶点信息进行可视化处理，建立药物—成分—靶点—疾病整体网络，并进行拓扑学分析。其中，成分和靶点在网络中以“节点”表示，成分与靶点之间的联系以“边”表示。

1.5 当归-红花治疗原发性痛经潜在靶点PPI网络的建立

使用STRING数据库(https:∥string-db.org/)获取当归-红花治疗原发性痛经潜在靶点之间的相互作用关系，并利用Cytoscape 3.7.0软件对上述关系进行可视化处理及网络拓扑学分析。

1.6 当归-红花治疗原发性痛经潜在靶点的生物功能注释(GO)和KEGG通路富集分析

将当归-红花治疗原发性痛经潜在靶点导入R语言(https:∥www.r-project.org/)中的Bioconductor生物信息软件包(DOSE[10]、clusterProfiler[11]、pathview[12]，http:∥www.bioconductor.org/)进行GO和KEGG通路富集分析。设置P<0.05为分析范围，获取当归-红花与原发性痛经潜在关联关系与作用机制的生物功能注释及主要作用通路，随后设置基因富集数量及P值为过滤条件，对排名前20的生物学功能和通路进行可视化处理。

2 结果与讨论

2.1 当归-红花治疗原发性痛经的潜在靶点预测

当归-红花中24个化学成分(羟基红花黄色素A暂无作用靶点)在TCMSP、SwissTargetPrediction、BindingDB、PharmMapper和BATMAN-TCM数据库中对应的作用靶点去除重复，共获得487个作用靶点。GeneCards、NCBI、TTD、CTD和OMIM数据库中对应原发性痛经的相关基因去除重复共775个靶点基因。24个化学成分和原发性痛经靶点基因进行映射，获得81个当归-红花治疗原发性痛经潜在靶点，结果见图1和表2。

表2 当归-红花治疗原发性痛经的潜在靶点Table 2 Potential targets of ASR-CF in the treatment of primary dysmenorrhea

图1 作用靶点韦恩图Fig.1 Venn diagram of targets

2.2 药物—成分—靶点—疾病整体网络分析结果

药物—成分—靶点—疾病整体网络结果见图2。由图2可知：该网络共有107个节点，441条边，最外圈为当归-红花治疗原发性痛经潜在靶点，内圈为化学成分。节点越大，其度值越大，即该节点在网络中越重要，故槲皮素、山奈酚、熊果酸、野黄芩素、咖啡酸、七叶亭、阿魏酸、东莨菪内酯、阿魏酸松柏酯和芦丁等成分和PTGS2、CA2、PTGS1、AKR1B1、CA3、ESR2、ALOX5、TTR、MMP2和EGFR等靶点在整体网络中具有重要作用，提示这些节点是当归-红花治疗原发性痛经的核心成分和靶点。

图2 药物—成分—靶点—疾病整体网络Fig.2 Drug-compound components-targets-disease network

槲皮素可通过影响体内花生四烯酸代谢途径从上游抑制地诺前列酮(PGE2)和环氧合酶2(COX-2)的合成[11]，其中PGE2的升高是导致痛经的主要机制，COX-2亦可催化生成PGE2，故槲皮素可通过抑制PGE2和COX-2的水平治疗原发性痛经。山奈酚可激活雌激素受体活性[12]，雌激素与受体结合可激活血清肥大细胞释放致痛物质，进一步导致痛经的发生，因此山奈酚可通过调节雌激素受体活性影响痛经进程。熊果酸能上调一氧化氮合酶(NOS)、NO水平[13]，NO可使局部血管舒张、平滑肌细胞舒张以及抑制血小板聚集，进而减轻痛经症状[14]，NOS是NO在体内的唯一限速酶，故熊果酸可通过上调NOS、NO水平减轻痛经症状。咖啡酸可抑制多种炎性介质的合成与释放，有效控制神经元氧化损伤，获得镇痛作用[15]。芦丁可阻止Ca2+内流并降低组织细胞Ca2+超载，亦能控制内皮素的变化和降低NO的异常增高[16]，细胞内Ca2+超载可引起子宫颈挛缩，导致痛经，内皮素与其受体结合后，促进子宫平滑肌和血管的收缩加速疼痛进程[2]，故芦丁通过阻止Ca2+内流、控制内皮素和NO水平干预痛经过程。综上，提示当归-红花中多种化学成分可通过多种机制发挥治疗原发性痛经的作用。

PTGS2、PTGS1又分别称COX-2、环氧合酶1(COX-1)，是花生四烯酸合成各种内源性前列腺素(PGs)过程中的限速酶，参与调节子宫肌细胞的收缩和舒张。PTGS1还是阿司匹林、布洛芬等临床常用治疗痛经的非甾体抗炎药的作用靶标，故PTGS2、PTGS1与痛经的发生发展密切相关[17]。AKR1B1可激活NF-κB，抑制TNF-α诱导的血管平滑肌细胞增殖，影响血管重塑[18]，如孙基丰等[19]证明其可参与血管炎、血管狭窄等多种存在氧化应激效应的心血管疾病。ESR2是一种雌激素受体，介导雌激素的基因型效应，雌激素可促进月经前期PGF2α的产生，参与痛经的发生发展[20]。ALOX5可催化机体生产花生四烯酸，进而生成不同类型的前列腺素，从而调节子宫肌细胞的收缩和舒张[21]。MMP2是一种Ca2+依赖性蛋白酶，可参与机体的炎症反应及缺血、缺氧损伤等[22]。表皮生长因子受体EGFR与机体平滑肌痉挛和中枢镇痛相关[1]。综上可见，当归-红花可通过作用于PTGS2、PTGS1、AKR1B1、ESR2、ALOX5、MMP2、EGFR等靶点干预痛经的发生发展。

2.3 当归-红花治疗原发性痛经潜在靶点PPI网络的分析结果

当归-红花治疗原发性痛经潜在靶点PPI网络的结果见图3。由图3可知：该网络包含81个节点和1 048条边。节点越大表明节点度值越大，即该节点在网络中越重要。ALB、INS、AKT1、IL-6、VEGFA、TNF、EGFR、PTGS2、ESR1等度值显著高于其余靶点，在PPI网络中起着桥梁作用，可能是当归-红花治疗原发性痛经的关键作用靶点。

图3 当归-红花治疗原发性痛经潜在靶点的PPI网络Fig.3 PPI network of primary dysmenorrhea targets of ASR-CF

蛋白质与蛋白质之间的相互作用构成了细胞生化反应网络的一个主要组成部分，对调控细胞及其信号有重要意义。PPI网络核心靶点与炎症、免疫调节相关的蛋白有IL-6、VEGFA、PTGS2和TNF，与激素水平调节相关的蛋白有PTGS2、EGFR和ESR1，与中枢镇痛相关的蛋白有ALB、EGFR，与平滑肌痉挛相关的蛋白有VEGFA。IL-6是一种在免疫细胞和非免疫细胞中均具有多种功能的炎性细胞因子，可介导免疫和炎症反应，进而导致子宫平滑肌缺血，产生缺氧疼痛，是导致痛经的一个潜在机制[23]。TNF是一种具有多种生物活性的多肽细胞因子，可激活细胞因子网络系统诱发炎性反应及钙平衡的改变，导致血管功能紊乱、血管损伤和诱发血栓形成[24]。VEGFA的主要功能为促进血管内皮细胞增殖和迁移生长，增加微血管通透性，加速血管生长，参与维持正常的月经周期，亦与雌激素水平和黄体形成具有较高的相关性[25]。黄体中期雌激素水平高峰可促进PGF2α生成，引发痛经。ESR1亦为一种雌激素受体，可以与雌激素发生特异性结合而形成二聚体，使激素发挥其生物学效应，从而对痛经过程产生影响[26]。故IL-6、TNF、VEGFA和ESR1等靶点可能是当归-红花治疗原发性痛经的关键作用靶点。槲皮素、山奈酚、熊果酸、野黄芩素、咖啡酸和七叶亭等主要化学成分通过作用于这些关键靶点而发挥治疗原发性痛经的作用。例如，槲皮素同时作用于IL-6、TNF和VEGFA；山奈酚同时作用于TNF和IL6；熊果酸和咖啡酸同时作用于ESR和TNF；野黄芩素作用于VEGFA。综上，这些化学成分与关键靶点形成紧密的互作网络，以“多成分、多靶点”模式共同作用于原发性痛经的治疗。

2.4 GO功能注释分析结果

GO功能注释共获得364个条目(P<0.05)，其中生物过程(BP)条目231个，细胞组成(CC)条目29个，分子功能(MF)条目104个。根据P<0.01，分别取排名前10的条目制作条形图，GO可视化结果见图4，同一颜色区域自左向右P值越大。由图4可知：当归-红花治疗原发性痛经生物过程涉及对类固醇激素的反应，激素代谢过程，类固醇代谢过程，活性氧代谢过程，活性氧代谢过程的调控，细胞激素代谢过程以及氧化应激反应等方面；细胞组成涉及囊腔，分泌颗粒腔，胞质小泡腔，血小板α颗粒管腔和血小板α颗粒等方面；分子功能主要集中于氧结合，类固醇羟化酶，血红素结合，铁离子结合，氧化还原酶活性和单加氧酶活性等方面。

图4 GO功能注释分析结果Fig.4 GO enrichment analysis of the key targets

2.5 KEGG通路富集分析结果

KEGG通路富集共获得132个条目(P<0.05)，具有显著意义的有119个条目(P<0.01)，剔除与疾病不相关的通路，筛选共得到27条与原发性痛经相关的通路，结果见表3。由表3可知：27条通路与激素调节相关通路有9条，分别是甾体激素生物合成，卵巢甾体生成，催乳素信号通路，雌激素信号通路，甲状腺激素信号通路，生长激素的合成、分泌和作用，孕酮介导的卵母细胞成熟，催产素信号通路以及甲状旁腺激素的合成、分泌和作用。与中枢镇痛相关通路有2条：FcεRI信号通路，氮代谢。与平滑肌解痉相关通路有3条：ErbB信号通路，血管内皮生长因子信号通路和PPAR信号通路；与炎症相关通路有9条：PI3K/AKT信号通路，IL-17信号通路，MAPK信号通路，JAK/STAT信号通路，血管内皮生长因子信号通路，Th17细胞分化，花生四烯酸代谢，NF-κB信号通路和NOD样受体信号通路。与免疫调节相关通路有5条：Toll样受体信号通路，T细胞受体信号通路，5-羟色胺能突触，趋化因子信号通路和B细胞受体信号通路。以上结果表明：当归-红花可通过激素调节、中枢镇痛、平滑肌解痉以及免疫调节等各个通路发挥作用，达到治疗原发性痛经的效果。

表3 KEGG通路富集分析结果Table 3 KEGG pathway enrichment analysis of the key targets

本研究对潜在作用靶点的通路注释结果发现：当归-红花可通过炎症，平滑肌解痉，中枢镇痛及激素水平调节通路治疗原发性痛经，亦能通过Toll样受体、T细胞受体等免疫调节信号通路，故当归-红花可能会通过增强机体免疫功能，协同抗炎、平滑肌解痉、中枢镇痛对原发性痛经产生全面的治疗作用。

3 结论

采用网络药理学方法，对当归-红花治疗原发性痛经的化学成分、作用靶点和通路等作用机制进行了系统分析，从分子水平初步阐述了当归-红花中槲皮素、山奈酚、熊果酸、野黄芩素、咖啡酸、七叶亭、阿魏酸、东莨菪内酯、阿魏酸松柏酯和芦丁等24个成分，可能通过与炎症、激素调节、中枢镇痛、平滑肌解痉以及免疫相关的27条通路，干预PTGS2、CA2、PTGS1、AKR1B1、CA3、ESR2、ALOX5、TTR、MMP2、EGFR等81个靶点，从而发挥治疗原发性痛经的作用。

方中成分或作用于多个靶点、通路，或多个成分共同作用于同一个靶点、通路。各类成分既有共同的作用靶点群及通路群，又各有倚重，各通路群间通过共有靶点连接，显示出不同成分间的多靶点协同作用，充分体现了中医药在治疗疾病的多成分、多靶点和多途径整合调节的作用特点。研究结果可为当归-红花治疗原发性痛经的作用机制提供一定的理论基础与科学依据，为后续深入验证当归-红花治疗原发性痛经的作用机制奠定一定的基础，也为中医药防治疾病的多维度、多层次研究提供了新的思路。