基于网络药理学和分子对接技术探讨精制冠心片治疗冠心病的机制

陈敏 邓萌萌伍蕊嗣周波韦袆潘晓鹃*

（1.西南医科大学药学院，四川 泸州646000； 2.四川省中医药科学院，四川 成都610041； 3.重庆市中药研究所，重庆404100）

冠状动脉粥样硬化性心脏病是冠状动脉血管发生动脉粥样硬化病变而引起血管腔狭窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或坏死而导致的心脏病，常被称为冠心病［1］。世界卫生组织将冠心病分为无症状心肌缺血（隐匿性冠心病）、心绞痛、心肌梗死、缺血性心力衰竭和猝死5 种临床类型［2］。冠心病的患病率在世界范围内不断增加，也呈现出逐渐年轻化的状态，其发病机制是体内脂质代谢异常，血管中脂质沉淀在动脉内膜上，出现类似于粥样的脂类物质，聚集成白色斑块，堵塞动脉血管，血液流动速度随之降低，导致心脏缺血，最终演变成冠状动脉粥样硬化性心脏病。病变过程是内皮细胞的改变，由线状形逐渐变为圆石块形状，使得单核细胞和巨噬细胞易于通过内皮到达皮下间隙，驱动动脉粥样硬化的发生［3］，同时脂蛋白水平增高，刺激低密度脂蛋白LDL 和其他脂蛋白聚集于病灶区，形成脂纹斑块。血管内膜增厚中膜变薄、血管外膜大量纤维化，逐渐形成纤维帽，继而演变为纤维斑块［4-5］。

中医认为冠心病分为本虚和标实2 种情况，通过辩证将这种疾病分为血瘀气滞型、阴寒内结型、痰浊闭阻型、痰瘀气足型、心肾阴虚型、心脾两虚型等［6］，按照类型的不同进行相关的治疗。治疗标实者可以单独治其标，补肾精者可重在标本兼治，本虚者可以根据气血阴阳亏虚不同采取相应的治疗方法［7-8］。鉴于中药复方成分复杂、靶点众多等原因，本研究利用网络药理学方法探讨中药复方的生物活性成分及作用靶点，并应用分子对接技术对关键药效成分和靶点进行验证，为进一步阐明精制冠心片活性成分、作用机制以及发挥临床疗效提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 精制冠心片活性成分与潜在靶点筛选 综合文献报道以及利用中药系统网络药理学分析平台（http：／ ／lsp.nwu.edu.cn／ tcmsp.php）分别输入“丹参”“赤芍”“红花”“降香”“川穹”5 味中药药名，查找活性成分，设定口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%且类药性（drug-likeness，DL）≥0.18 为筛选条件，收集符合条件的有效成分。综合考虑该化学成分的含量及生物学效应等多方面因素，最终确定为活性成分，通过TCMSP 数据库预测其靶点蛋白。在Uniprot 数据库（https：／ ／www.uniprot.org／）中将靶点蛋白名转换为靶点基因名。

1.2 确定疾病靶点 通过OMIM 数据库（https：／ ／www.omim.org／）以 及 GeneCards 数据库（https：／ ／www.genecards.org／）搜集与冠心病相关的疾病靶点，将数据库中的疾病基因导入excel 表格中合并数据，剔除重合基因条目，最终获得冠心病相关基因。

1.3 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络的构建 将精制冠心片和冠心病共同作用靶点以gene symbol 形式上传至STRING［9］（https：／ ／string-db.org／）数据库中，构建蛋白质相互作用网络，将物种设定为“Homo sapiens”，最低相互作用阈值设置为“highest confidence”（＞0.9），隐藏游离蛋白，其他参数保持默认设置进行操作，将文件保存为TSV 格式。

1.4 中药-成分-靶点网络构建 通过数据筛选获得精制冠心片活性成分潜在作用靶点及冠心病疾病靶点，通过韦恩图取交集得到2 者共同靶点112个，利用Cytoscape 3.8.0软件构建“中药-成分-基因靶点”相互作用网络图，药物活性成分和作用靶点以“节点”表示，节点之间的相互作用以“边”表示。

1.5 基因本体（GO）富集分析和基因组百科全书（KEGG）通路富集分析 利用DAVID 数据库（https：／ ／david.ncifcrf.gov／）对精制冠心片和冠心病共同作用靶点蛋白进行GO 功能和KEGG 通路富集分析，筛选P＜0.05 的前20个条目，借助 omicshare网站（https：／ ／www.omicshare.com／）进行数据可视化处理，以阐释精制冠心片治疗冠心病的生物功能及相关信号通路，结果以柱形图和气泡图形式呈现。

1.6 分子对接验证 从PDB 数据库（http：／ ／www.rcsb.org／）中下载核心靶点蛋白质结构，利用PyMol 2.3.4 软件对核心蛋白进行去水、分离原配体等操作，保存后导入Autodock 4.2.6 软件加氢、设置原子类型，保存为“pdbqt”格式。在TCMSP 数据库中下载小分子结构，保存为“mol2”结构，利用Autodock 进行核心成分的分子对接。结合能代表受体与配体之间的作用力，结合能越低，氢键数目越多，构象越稳定，其能量越低，相互作用的可能性就越大［10］。通常认为，结合能绝对值大于4.25 kJ／mol 代表配体与受体之间有一定的结合力；大于5.0 kJ／mol 表示有较好的结合活性；大于7 kJ／mol 表明结合活性强烈。

2 结果

2.1 精制冠心片活性成分筛选 通过TCMSP 数据库，以OB≥30%，DL≥0.18 进行筛选，剔除无对应靶点成分，得到丹参、赤芍、红花、降香、川穹的有效化合物160个，其中丹参65个，赤芍29个，红花22个，降香37个，川芎7个，有效化合物信息如表1 所示。

表1 精制冠心片候选化合物

续表1

续表1

续表1

2.2 冠心病疾病靶点筛选 在疾病靶点数据库（OMIM 和GeneCards）查找检索冠心病的疾病作用靶点，挖掘并删除重复靶点，共收集到潜在疾病靶点1 368个，将得到的靶点信息进行基因名和Uniprot ID 的标准化。利用韦恩图获得精制冠心片和冠心病两者的共同作用靶点112 个。由图1 可知，精制冠心片可以通过多种成分作用于冠心病疾病的多个相关靶点来发挥抗冠心病的作用。

图1 “药物-疾病”交集靶基因韦恩图

2.3 PPI 网络构建及分析 应用STRING 数据库，构建精制冠心片治疗冠心病潜在靶点PPI 网络，将结果见图2，共有节点60个，边数233条，平均节点数为7.77，平均局部聚类系数为0.557。

图2 精制冠心片治疗冠心病的蛋白相互作用网络

2.4 中药—成分—靶点网络的构建及分析结果 将精制冠心片活性成分和作用靶点信息导入Cytoscape 3.8.0 软件，构建“中药-成分-靶点”网络图，共包含360 个节点，2 006条边（图3）。在网络中，一个节点的度（degree）表示网络中和节点相连路线的条数，度值越大则表明该化合物发挥作用的可能性越大，各节点根据degree 值呈现为不同大小。菱形代表基因靶点，圆形代表各中药成分，正六边形代表各中药所共有的靶点。通过网络拓扑分析可以得出，该网络中，度值大于等于50（中位数）的化合物有13个，包括6-羟基山柰酚（degree ＝69）、川芎哚（degree ＝102）、柳杉酚（degree＝56）、黄檀素（degree ＝65）、杨梅酮（degree ＝78）、丹参酮ⅡA（degree ＝109）、芍药苷（degree＝77）、隐丹参酮（degree ＝89）、丹参酮Ⅰ（degree ＝91）、山柰素（degree ＝53）等，因此可以推测上述成分可能是精制冠心片治疗冠心病的重要成分。

图3 中药-成分-靶点网络图

2.5 GO 功能富集分析 在DAVID 数据库，对精制冠心片和冠心病的共同靶点进行GO 功能富集分析，得到20 个生物过程、88 个细胞组分、167 个分子功能。富集结果表明，精制冠心片治疗冠心病的生物过程主要与细胞内信号的正向转导、细胞群的增殖、细胞的积极代谢、细胞对化学、压力、药物刺激、含氧化合物等的反应有关（图4A）；细胞组分主要涉及膜筏、小窝、内膜系统、囊泡、质膜、核染色质、肌膜炎、空泡、溶酶体、Z 盘等（图4B）；分子功能主要集中于蛋白质二聚活性、细胞因子活性、脂质结合、转录因子结合、信号受体活性、过氧化物酶活性、G蛋白偶联的胺受体活性、花生四烯酸结合、NFAT 蛋白结合、胰岛素样生长因子Ⅱ结合（图4C）。分析结果显示，冠心病涉及体内多个生物学过程，精制冠心片可能通过调节这些生物过程起到治疗冠心病的作用。

图4 GO 富集结果柱形图

2.6 KEGG 通路富集分析 对精制冠心片和冠心病的共同靶点进行KEGG 通路富集分析，结果以P＜0.05 筛选，共有119 条信号通路出现富集，以Count 值降序筛选排名前20的KEGG 通路输出气泡图（图5）。其中节点的大小表示富集到的靶点数量，节点的颜色由红色至蓝色表明P值由大到小。因此，红色节点越大信号通路的显著性就越高，说明该信号通路的重要性越高，排除广泛通路后，表2 中列出了排名前20 的信号通路。经分析，主要分布于肿瘤坏死因子信号通路、HIF-1 信号通路、Toll 样受体信号通路、VEGF 信号通路、NOD 样受体信号通路、T 细胞受体信号通路、MAPK 信号通路等通路中。

表2 KEGG 关系网络中Degree 值前20 的靶标

图5 KEGG 通路富集分析结果

2.7 分子对接验证 如表3 所示，4 个成分的结合力均小于0，说明其与靶点产生自发性结合。芍药苷与ADRB2 靶点结合能为-8.0 kJ／mol，氢键数目为3；丹参酮ⅡA与ADRB2 的结合能最大为-9.6 kJ／mol，氢键数目为1。对接结果表明，精制冠心片中关键活性成分与核心靶点结合能力低，相互之间结合性好生物活性高，是精制冠心片治疗冠心病的关键，见图6。

图6 蛋白对接构象

表3 核心成分与靶点的结合情况

3 讨论

本文使用网络药理学的研究方法挖掘精制冠心片的有效入血成分，对冠心病的作用靶点及涉及的通路进行研究。从靶点、信号通路的角度阐释精制冠心片治疗冠心病的作用机制，以及利用分子对接技术验证了主要活性成分与核心靶点具有较好的结合作用。构建精制冠心片治疗冠心病的“中药-活性成分-靶点”交互网络图，筛选出精制冠心片的165 个活性成分及112 个与疾病共同的作用靶点，使用网络拓扑分析方法筛选出13 个显著有效化合物。GO 富集和KEGG 富集显示涉及20 个生物过程，88 个细胞组分、167 个分子功能，119 条信号通路。PPI 网络分析及分子对接验证，得到精制冠心片治疗冠心病关联性最强的核心靶点是PTGS2、NCOA2、ADRB2 等。上述靶点与炎症调节、体内凝血系统、脂质代谢系统等密切相关。GO 富集分析显示，精制冠心片治疗冠心病与G 蛋白偶联胺受体、肾上腺素受体等有关。KEGG 通路富集分析显示，精制冠心片对冠心病的治疗涉及IL-17 信号通路、PI3K-Akt 信号通路［11-12］、HIF-1 信号通路等。

丹参中的有效化合物丹参酮ⅡA具有抗凝血、抗动脉粥样硬化、调节血脂等作用［13-14］。川芎中的川芎嗪可改善冠状动脉的血液循环，减轻缺血所引起的心肌细胞损伤，抑制血清肌酸磷酸激酶和乳酸脱氢酶的溢出，减小缺血范围，促进纤维蛋白降解，对抗体外血浆凝血，从而达到治疗冠心病的目的［15-16］。红花中的主要活性成分山柰素具有抗心肌缺血、抑制血小板聚集、抗氧化，增加冠状动脉血流量和降低冠状动脉阻力等作用，还能抑制动脉粥样硬化血管中内皮细胞的增殖，阻止内皮细胞过度增生，稳定血管内膜等作用［17-18］。赤芍的主要化合物具有扩张冠状动脉、增加冠状动脉血流量，抑制血小板聚集等作用［19-20］。研究显示，川芎和赤芍合用或单用均可降低血清中TC、TG、LDL 水平，合用可提高超氧化物歧化酶（SOD）活性和降低丙二醛（MDA）水平，在提高血管内皮细胞抗氧化能力及促进NO 释放方面产生协同作用［21］。降香的主要化学成分包含挥发油类和黄酮类化合物，具有舒张血管、增加冠脉血流、抗氧化、抗炎、抗肿瘤等作用［22-23］。

综上所述，精制冠心片中的丹参酮ⅡA、芍药苷、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、6-羟基山柰酚、川芎哚、柳杉酚等有效化合物可能通过HIF-1、Toll 样受体、VEGF、NOD 样受体、T 细胞受体等信号通路作用于PTGS2、PTGS1、NCOA2、ADRB2 等靶点发挥抗炎、降脂、抗动脉粥样硬化等作用。基于网络药理学及分子对接技术预测结果与已有文献结果较为相近，体现了此方法具有一定的准确性，同时契合中药整体观、系统性的理念，为进一步阐述精制冠心片治疗冠心病提供参考。