当归补血汤及其活性成分通过NLRP3／ASC／caspase-1 通路调控糖尿病大鼠动脉粥样硬化及网络药理学研究

李秋芳 王文恺龚曼 傅金英代丽萍王舒珣刘雅琳*

［1.河南中医药大学，河南 郑州45004； 2.河南省中医院（河南中医药大学第二附属医院），河南 郑州450002； 3.南京中医药大学，江苏 南京210024； 4.河南省道地药材综合开发与利用工程中心，河南郑州450046］

随着现代社会生活的改变，糖尿病的患病率在逐年上升，已成为全球威胁人类健康的三大慢性非传染性疾病之一［1］。在糖尿病患者中，动脉粥样硬化是最为常见的并发症［2］，并最终导致冠心病、脑血管意外和下肢坏疽等［3］。炎症反应是动脉粥样硬化形成的重要环节，大量临床及试验研究发现，糖尿病动脉粥样硬化的发病与NLRP3／ASC／caspase-1 信号通路密切相关［4-6］。

当归补血汤出自李东垣的《内外伤辨惑论》，由黄芪、当归按5∶1 比例组成，具有补气生血的功效。糖尿病早期病因为燥热伤阴，随着疾病发展，阴伤及气，导致气阴两虚，而“气为血之帅”，故气虚则运血生血无力，出现血虚燥热及瘀血阻滞。由此可见，糖尿病治疗的关键在于补气生血滋阴，而当归补血汤的功效正契合其病因病机。课题组前期研究了当归补血汤的疗效及其机理，发现该方可降低动脉粥样硬化模型大鼠C-反应蛋白和TNF-α 水平，具有抗炎抗氧化作用，还能能调节血脂、抑制主动脉MCP-1、ICAM-1 和CD36 的基因表达［7-8］。本课题组前期实验也研究了芒柄花素、毛蕊异黄酮、阿魏酸、黄芪甲苷为当归补血汤吸收入血活性成分（absorbed bioactive compounds，ABCs）的药代动力学规律［9］。此外，网络药理学作为一种基于系统生物学阐述疾病发生发展及药物作用的新兴学科，对发现药物潜在药理机制有巨大帮助。

本研究采用动物实验，首次揭示了当归补血汤及ABCs通过NLRP3／ASC／caspase-1 信号通路干预糖尿病动脉粥样硬化的物质基础及作用机制，此外结合网络药理学方法探讨其他可能的作用机制，为全面解析当归补血汤及ABCs的作用机制奠定基础。

1 材料

1.1 动物 40 只雄性SPF 级SD 大鼠，体质量（270±10）g，购自山东省实验动物中心，实验动物生产许可证号SCXK（鲁）2014-0007。动物于河南中医药大学动物实验中心标准化饲养，恒温（23±1）℃，相对湿度（50±5）%，自由饮水饮食。高脂高糖饲料由基础饲料加入脂肪15%、蔗糖20%、鸡蛋5%、胆固醇1%、食盐0.1%，由郑州大学实验动物中心提供。

1.2 试剂与药物 黄芪（批号180621）、当归（批号180801）购自亳州市张仲景中药饮片有限公司。芒柄花素（批号RQ1833）、阿魏酸（批号RQ18R920）、黄芪甲苷（批号RQ1214）对照品购自上海瑞生生物科技有限公司，纯度98%；毛蕊异黄酮（批号Wkq19011810）购自四川省维克奇生物科技有限公司，纯度98%；链脲佐菌素（批号RK18S1206）、NF-κB、TNF-α、IL-6、ICAM-1 试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司；RIPA 裂解液（货号G2002）、β-actin 多克隆一抗（货号GB12001）、caspase-1 多克隆一抗（货号GB11383）均购自武汉赛维尔生物科技有限公司；NLRP3 多克隆一抗（货号ab214185）购自英国Abcam 公司；IL-18 多克隆一抗（货号10663-1-ap）购自美国CST公司。

1.3 仪器 电子天平［型号PL-203，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司］；离心机（型号D1008E）、匀浆仪（型号KZ-II，武汉赛维尔生物科技有限公司）；酶标检测仪（型号Rt2100c，深圳雷杜生命科学股份有限公司）；凝胶成像仪（型号V300，日本EPSON 公司）；石蜡切片机（型号RM2235，德国Leica公司）；双垂直电泳仪（型 号DYCZ-24DN）、转印电泳仪（型号DYCZ-40D）购自北京六一生物技术有限公司。

2 方法

2.1 当归补血汤灌胃汤剂的制备 根据处方依次称取黄芪500 g、当归100 g，置于圆底烧瓶中，加10 倍量蒸馏水，室温浸泡60 min后，电热套加热至沸腾开始计时，煎煮30 min，纱布过滤，滤渣再加6 倍量蒸馏水，搅拌均匀后继续煎煮30 min，过滤，合并2 次滤液，置于旋转蒸发仪中，60 ℃下旋转蒸发至1 500 mL，即得当归补血汤质量浓度为0.4 g／mL，低温保存，备用。

2.2 动物分组与给药 将40 只SD 大鼠适应性喂养1 周后，随机分为正常对照组、模型组、当归补血汤组（4 g／kg）、ABCs 组（剂量浓度相当于课题组前期测得母方的量［10］，即芒柄花素2.68 mg／kg，毛蕊异黄酮2.56 mg／kg，阿魏酸1.36 mg／kg，黄芪甲苷0.45 mg／kg），每组10 只大鼠，除正常对照组喂食基础饲料外，其余各组大鼠给予高脂高糖饲料进行喂养，均自由饮水。造模成功后的大鼠灌胃给药，灌胃容量为10 mL／kg，ABCs 组灌胃由芒柄花素、毛蕊异黄酮、阿魏酸、黄芪甲苷组成的ABCs 混合溶液，当归补血汤组灌胃当归补血汤，正常对照组与模型组灌胃等体积的生理盐水，每天1次，持续4 周。

2.3 糖尿病动脉粥样硬化模型的建立 大鼠隔夜空腹12 h后右侧腹腔注射进行造模，其中模型组、ABCs 组、当归补血汤组注射1% STZ 60 mg／kg，并在此期间继续喂以高糖高脂饲料［11］；正常对照组注射相等剂量的柠檬酸钠缓冲液并喂以普通饲料。大鼠成模判定标准为注射后第3、7 天检测血糖，如随机血糖≥16.9 mmol／L；或出现多饮、多尿、消瘦、乏力、懒动等症状，且连续2 次随机血糖＞11.1 mmol／L，即视为糖尿病造模成功。

2.4 大鼠一般情况记录 观察大鼠一般情况：包括精神状态、行为活动、毛发、毛色、清洁度、排便排尿情况等。每周称量1 次大鼠体质量，检测1 次随机血糖，给药结束后记录大鼠24 h 内摄食、饮水量，处死前禁食12 h 测空腹血糖。

2.5 血清炎症因子检测 末次灌胃2 h后，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，腹主动脉取血，4 ℃、3 500 r／min离心10 min 得到血清，分装后于-80 ℃保存。检测前4 ℃融化样本，严格按照ELISA 试剂盒说明书检测血清NF-κB、TNF-α、IL-6、ICAM-1 水平。

2.6 蛋白免疫印迹 称取主动脉组织100 mg，加入裂解液，匀浆提取总蛋白，BCA 法进行蛋白定量，确定上样体积。每组样品加入1／4 体积的5×Loading buffer 后煮沸5 min，-80 ℃保存备用。配制分离胶和浓缩胶，将样品加入电泳孔中，电泳条件为浓缩胶用电压75 V，分离胶用120 V，200 mA 电流转膜1 h后，将膜放入含5 %脱脂奶粉的TBST 溶液中室温封闭1 h，按1∶1 000 比例加入一抗稀释液，4 ℃过夜，次日孵育二抗、洗膜、显影。条带经Alpha 软件处理系统分析目标带的灰度值，β-actin 为内参，数据以目的条带与内参条带的灰度比值表示。

2.7 大鼠主动脉病理切片分析 取主动脉根部，用10%甲醛固定，脱水，石蜡包埋，制片（4 μm），HE 染色，光学显微镜下观察血管部位脂质沉积、纤维变性程度、炎症范围等。

2.8 网络药理学分析 从TCMSP（http：／ ／ lsp.nwu.edu.cn／tcmsp.php）数据库收集当归补血汤成分及其吸收生物活性成分。Swiss Target Prediction（http：／ ／www.swisstargetprediction.ch／）和 SEA（http：／ ／sea.bkslab.org／）数据库来检索与化合物相关的作用靶点；以血管内皮炎症（vascular endothelial inflammation）、动脉粥样硬化（atherosclerosis）、糖尿病（diabetes）为 关键词，从GeneCards（https：／ ／www.genecards.org／），OMIM（http：／ ／www.omim.org／）两个数据库中筛选疾病相关靶点。通 过STRING（https：／ ／string-db.org／，版本11.0）数据库将检索得到的当归补血汤有效成分与糖尿病、动脉粥样硬化、血管内皮炎症的关联靶点进行蛋白互作分析。通过KOBAS3.0 对当归补血汤治疗疾病的候选靶点进行KEGG 通路富集分析，使用https：／ ／www.omicshare.com／tools／在线工具绘制KEGG 气泡图。用Cytoscape 3.6.0 构建“成分-核心靶点-通路”相互作用网络图。

2.9 统计学分析 通过SPSS 22.0 软件进行处理，计量资料据用（）表示，两两比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05 表示差异有统计学意义。柱状图用GraphPad Prism 8.4 软件绘制。

3 结果

3.1 当归补血汤及吸收生物活性成分对大鼠体质量、随机血糖的影响 与正常对照组比较，模型组大鼠出现明显多饮、多尿、乏力、懒动等症状，毛发萎黄，排泄物稀烂臭秽难闻，体质量上升不明显，2 周后体质量下降（P＜0.01），随机血糖始终高于正常对照组（P＜0.01）；与模型组比较，给予当归补血汤和吸收生物活性成分后大鼠糖尿病症状改善，体质量增加，随机血糖逐渐降低（P＜0.01），见图1。

图1 当归补血汤及吸收生物活性成分对大鼠体质量、随机血糖的影响（， n＝10）

3.2 当归补血汤及吸收生物活性成分对大鼠24 h 摄食、饮水量及空腹血糖的影响 与正常对照组比较，模型组大鼠24 h 摄食量、饮水量增多（P＜0.05），空腹血糖升高（P＜0.01）；与模型组比较，当归补血汤和吸收生物活性成分能减少大鼠摄食、饮水量（P＜0.05，P＜0.01），降低空腹血糖（P＜0.01），改善糖尿病基础症状，见图2。

图2 当归补血汤及吸收生物活性成分对大鼠24 h 摄食、饮水量及空腹血糖的影响（， n＝10）

3.3 当归补血汤及吸收生物活性成分对大鼠血清NF-κB、TNF-α、IL-6、ICAM-1 水平的影响 如表1 所示，与正常对照组比较，模型组大鼠血清NF-κB、TNF-α、IL-6、ICAM-1 水平升高（P＜0.01）；与模型组比较，给予当归补血汤后，大鼠血清NF-κB、TNF-α、IL-6、ICAM-1 水平均降低（P＜0.05，P＜0.01），同时，吸收生物活性成分发挥了与原方剂相似作用。

表1 当归补血汤及吸收生物活性成分组对大鼠血清NF-κB、TNF-α、IL-6、ICAM-1 水平的影响（， n＝10）

表1 当归补血汤及吸收生物活性成分组对大鼠血清NF-κB、TNF-α、IL-6、ICAM-1 水平的影响（， n＝10）

注：与正常对照组比较，＃＃P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.4 当归补血汤及吸收生物活性成分对大鼠主动脉NLRP3／ASC／caspase-1 信号通路蛋白表达的影响 与正常对照组比较，模型组大鼠主动脉中caspase-1、IL-18、NLRP3、IL-1β、ASC 蛋白表达升高（P＜0.01）；与模型组比较，吸收生物活性成分组和当归补血汤组大鼠主动脉中caspase-1、IL-18、NLRP3、IL-1β、ASC 蛋白表达均降低（P＜0.01），见图3。

图3 当归补血汤及吸收生物活性成分对大鼠主动脉NLRP3／ASC／caspase-1 信号通路蛋白表达的影响（， n＝8）

3.5 当归补血汤及吸收生物活性成分对大鼠主动脉组织病理结构的影响 正常对照组大鼠主动脉组织结构正常，内膜、中膜、外膜分界清楚，内膜光滑完整，内皮细胞排列紧密，未见炎性细胞及脂质沉积；与正常对照组比较，模型组大鼠主动脉组织结构紊乱，内膜不光滑不完整，内膜增厚，中膜有炎性细胞及脂质沉积；与模型组比较，当归补血汤和吸收生物活性成分组可见斑块面积及病变有不同程度的减轻，内皮较完整，中膜未见明显脂质沉积，见图4。

图4 当归补血汤及吸收生物活性成分对大鼠主动脉组织病理结构的影响（HE，×400）

3.6 网络药理学分析 通过TCMSP 数据库及相关文献检索收集得到当归补血汤（当归、黄芪）中的化合物共22种，其中来自当归的2种，来自黄芪的20种，ABCs 共4 个成分，其中芒柄花素、毛蕊异黄酮、黄芪甲苷来源于黄芪，阿魏酸来源于当归。删除重复成分后，得到24 个化合物，见表2。从数据库中筛选当归补血汤成分相关靶点663个，从疾病数据库中筛选疾病相关靶点删除重复值后得到糖尿病（14 950 个）、动脉粥样硬化（4 481 个）、血管内皮炎症（7 677 个）相关靶点。使用在线绘图工具对当归补血汤化学成分的对应靶点和疾病靶点进行韦恩图分析，可以看出当归补血汤与糖尿病、动脉粥样硬化、血管内皮炎症共有396 个交集靶点，见图5。采用Cytoscape 3.6.0 构建成分-靶点网络图，可见ABCs 各成分靶点较多，见图6。对核心靶点进行蛋白互作分析，结果显示PIK3CA、PIK3R1、MAPK1、MAPK3、SRC、AKT1、APP、STAT3、FYN、HSP90AA1 为当归补血汤治疗糖尿病、动脉粥样硬化及血管内皮炎症的核心靶点，见图7；Mol-3（阿魏酸）、Mol-17、Mol-24（黄芪甲苷）、Mol-8、Mol-19、Mol-16、Mol-13、Mol-12、Mol-10、Mol-9 是当归补血汤治疗糖尿病、动脉粥样硬化及血管内皮炎症的核心成分，见图6。KEGG 分析结果表明，当归补血汤治疗作用可能与PI3K-Akt 信号通路（hsa04151）、糖尿病并发症中的AGE-RAGE 信号通路（hsa04933）相关，见图8。

图6 成分-靶点网络图

图7 蛋白-蛋白相互作用网络

图8 KEGG 富集分析

表2 当归补血汤候选化合物的网络信息图

图5 当归补血汤治疗疾病潜在靶点

4 讨论

中医理论认为糖尿病动脉粥样硬化的病因病机为饮食不节、喜食肥甘、积热内蕴、耗气伤阴、气虚日久、运血无力而致瘀血内阻、脉络不通、筋失所养、脉管堵塞［12-13］，同时大量的临床证据表明，气阴两虚、气血亏虚是糖尿病动脉粥样硬化的主要证型［14］。糖尿病动脉粥样硬化患者普遍存在肥胖，血糖异常升高，同时存在红细胞参数下降、血小板活化、凝血因子活性改变等病理变化，可引起血液黏稠、血栓形成、动脉血流量下降等改变，与中医学“气血亏虚型血瘀”的形成机制相吻合［15-17］。当归补血汤方中黄芪补气，推动体内瘀滞的气血运行，疏通堵塞脉管；当归养血，濡养干枯筋脉，从而实现气血双补。故本研究选用补气生血的代表方当归补血汤为研究对象具有较高的临床研究价值。

糖尿病动脉粥样硬化是一种复杂的临床疾病，其发病机制尚不明确，主流观点有内皮细胞功能紊乱、血脂代谢异常、血小板功能及凝血机制异常、全身低度炎症状态、机体氧化应激状态等［18］，其中NLRP3／ASC／caspase-1 炎症信号通路得到越来越多的关注。本实验研究结果显示，ABCs 与当归补血汤均可下调NLRP3／ASC／caspase-1 信号通路蛋白表达，降低下游炎症因子水平，具有抗炎作用，同时，ABCs 与当归补血汤组大鼠动脉斑块面积较模型组明显减少。因此，本实验结果提示ABCs 能够代表母方当归补血汤发挥对糖尿病动脉粥样硬化大鼠的治疗作用，但治疗作用不及母方，可能与当归补血汤中含有的多糖、氨基酸、微量元素等作用相关，需要进一步的深入研究。同时，网络药理学预测表明当归补血汤及ABCs 改善糖尿病、动脉粥样硬化及血管内皮炎症的核心靶点为PIK3CA、PIK3R1、MAPK1、MAPK3、SRC、AKT1等，ABCs 中阿魏酸、黄芪甲苷为核心活性成分，其作用机制可能还与PI3K-Akt 信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE 信号通路有关，PI3KAkt 信号通路处于NLRP3／ASC／caspase-1 信号通路上游，有待进行进一步深入研究。

综上所述，本文首次报道了ABCs 作为当归补血汤治疗糖尿病动脉粥样硬化的核心成分群，尤其是阿魏酸、黄芪甲苷可能发挥主要作用。当归补血汤通过NLRP3／ASC／caspase-1 信号通路发挥调节糖尿病动脉粥样硬化的作用，而本实验为后期全面揭示其作用机制奠定了物质和理论基础。