委陵菜酸调控PI3K／Akt／mTOR 通路对肝星状细胞活化增殖的影响

李艳张晓琳韦园园温淑娟林兴黄权芳

（1.广西医科大学，广西 南宁530021； 2.广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁530023）

肝纤维化是肝脏对各种慢性刺激进行的损伤修复反应，也是以胶原为主的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）在肝内大量沉积的病理过程［1-2］。肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSCs）是ECM 的主要来源，在肝纤维化的发展进程中发挥着关键的作用［3］。活化的HSCs 可通过在肝损伤部位移行、增殖，表达各种信号传导蛋白，并产生大量细胞因子和以胶原为主的细胞外基质成分，是肝纤维化形成的始动环节［4］。PI3K／Akt／mTOR 通路是参与肝纤维化发生发展的重要信号传导通路之一［5］，可调节HSCs 增殖、活化和凋亡，是目前治疗肝纤维化较有效的干预靶点［3］。

中药具有多成分、多环节、多靶点的作用特点，对病理复杂的肝纤维化可发挥综合优势［6］。委陵菜是蔷薇科植物委陵菜Potentilla chinensisSer.的全草，在前期对委陵菜进行化学成分提取、分离及其活性成分筛选研究中，得到委陵菜酸，并在LPS／D-GalN 诱导的小鼠肝损伤模型中发现，委陵菜酸可降低炎症相关因子的表达，抑制NF-κB 活性，减轻肝组织病理的损伤程度［7］。本研究以PI3K／Akt／mTOR 信号通路为切入点，探讨委陵菜酸对血小板衍生因子-BB（platelet derived growth factor-BB，PDGF-BB）诱导活化的肝星状细胞LX-2 的抗纤维化作用机制，为其治疗肝纤维化提供依据。

1 材料

1.1 细胞 人肝星状细胞株LX-2 购自上海美轩生物科技有限公司。

1.2 试剂与药物 人PDGF-BB（美国PeproTech 公司，批号 0507CY420 ）；PI3K 抑制剂 LY294002（美 国Medchemexpress 公司）；DMEM 高糖培养基（美国HyClone公司）；胎牛血清（澳大利亚AusGeneX 公司）；兔抗Collagen-I 多克隆抗体、鼠抗PI3K 多克隆抗体、兔抗mTOR多克隆抗体（美国Proterntech 公司）；兔抗磷酸化PI3K 多克隆抗体（美国Signalway Antibody 公司，批号5602）；兔抗Akt 多克隆抗体、兔抗磷酸化Akt 多克隆抗体、兔抗磷酸化mTOR 多克隆抗体、兔抗P70S6K 多克隆抗体、兔抗磷酸化P70S6K 多克隆抗体（美国Cell Signaling Technology公司）；PCR 试剂盒（日本TaKaRa 公司）；BCA 试剂盒（南京建成生物工程研究所）；Western 转膜液、封闭液（上海碧云天生物技术有限公司）；聚偏氟乙烯（PVDF）膜（美国Millipore 公司，批号R5HA8393E）。委陵菜酸（纯度90.08%），提取分离参照前期研究方法［7］。

1.3 仪器 超微量分光光度计、酶联免疫检测仪（美国Thermo Fisher 公司）；7300 荧光定量PCR 仪（美国Applied Biosystem 公司）；双色红外荧光扫描成像系统（美国LICOR 公司）。

2 方法

2.1 委陵菜酸的配制 称取适量委陵菜酸加入DMSO 溶解，配置成浓度10 mmol／L 的溶液，用0.22 μm 微孔滤膜过滤，即得，于-80 ℃冰箱保存备用。

2.2 细胞培养和分组 设置6 个组，分别为正常组、刺激组（PDGF-BB 20 ng／mL）、LY294002 组（PDGF-BB 20 ng／mL ＋LY294002 20 μmol／L）和委陵菜酸高、中、低剂量组（PDGF-BB 20 ng／mL＋委陵菜酸35、25、15 μmol／L）。将LX-2 细胞株置于含10% 胎牛血清、1% 青霉素-链霉素的1640 培养液中，于37 ℃、5% CO2培养箱中贴壁培养，每1～2 d 更换培养液。待细胞生长至单层致密状，弃培养液，PBS 洗2次，用0.25%胰蛋白酶消化并传代或冻存。

2.3 MTT 法检测细胞增殖情况 取对数生长期LX-2 细胞接种于96 孔板培养24 h，加入委陵菜酸（10～60 μmol／L）继续培养24 h，加入MTT 溶液10 μL，使用酶标仪于490 nm波长测各孔光密度（OD）值，计算半抑制浓度（IC50）。LX-2 细胞接种于96 孔板，除正常组外，其余各组用20 ng／mL PDGF-BB 预处理30 min，刺激组加入完全培养基，药物组分别加入15、25、35 μmol／L 委陵菜酸和20 μmol／L 的LY294002，作用24 h 后弃去原培养基，每孔加入90 μL 无血清培养基和10 μL MTT 继续培养4 h，弃去培养基后加入100 μL DMSO，使用酶标仪在490 nm处检测每个孔的OD值，计算抑制率。

2.4 LDH 活性的检测 将LX-2 细胞以每孔1×104个的密度接种于96 孔板，待细胞生长贴壁后，按“2.3”项下分组和给药，培养24 h。收集上清液，按说明书步骤处理后，使用酶标仪在450 nm 处检测OD值，并对细胞LDH 值进行量化［8］。

2.5 细胞迁移实验 取对数生长期LX-2 细胞接种于6 孔板，待细胞贴壁后，用枪头垂直于直尺，对单层细胞划出一条无细胞的刮除带，用PBS 洗去划下的细胞后，按“2.3”项下分组和给药，并分2 个时间段（0、24 h）观察并拍照［9］。

2.6 集落生成实验 取对数生长期LX-2 细胞接种于6 孔板，细胞密度为每孔500 个。第2 天更换为无血清培养基，同步化饥饿细胞6 h。按“2.3”项下分组和给药，将6 孔板置于恒温培养箱中继续培养7 d，用0.1%结晶紫对细胞固定染色，在显微镜下观察菌落大小和数量等集落的生成情况。50 个以上细胞组成的细胞团，计为1 个集落。

2.7 RT-qPCR 法检测相关基因mRNA 表达 收集各组细胞，采用Trizol 一步法提取细胞RNA，用超微量分光光度法检测总RNA 浓度，并通过逆转录得到cDNA。采用PCR仪以20 μL 体系开始扩增，扩增条件为95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火延伸31 s，循环40次［10］，引物序列见表1。

表1 引物序列表

2.8 蛋白免疫印迹法检测相关蛋白表达 收集各组细胞，加入含RIPA 缓冲液、1%蛋白酶抑制剂和1%磷酸酶抑制剂的裂解液裂解细胞，冰面上静置10 mim，离心取上清液［11］，即得，用BCA 试剂盒检测蛋白浓度。用10% SDSPAGE 凝胶将蛋白质按分子量大小进行分离，电泳结束后，将蛋白质转移到PVDF 膜上，封闭后与一抗4 ℃孵育过夜，辣根过氧化物酶标记的大鼠IgG 二抗孵育，免疫反应带的强度用双色红外荧光扫描成像测定，采用Image-Pro Plus 图像分析管理系统分析［7］。

2.9 统计学分析 采用SPSS 17.0 软件进行处理，结果以（）表示，经方差齐性检验，方差齐则采用单因素方差分析；方差不齐则采用秩和检验。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 委陵菜酸对PDGF-BB 刺激LX-2 细胞LDH 活性的影响 委陵菜酸对LX-2 细胞IC50为43.287 μmol／L。与刺激组比较，药物干预后LX-2 细胞LDH 活性随浓度增加而升高（P＜0.01），对细胞有一定毒性，见表2。

表2 委陵菜酸对PDGF-BB 刺激LX-2 细胞LDH 活性的影响（， n＝3）

表2 委陵菜酸对PDGF-BB 刺激LX-2 细胞LDH 活性的影响（， n＝3）

注：与正常组比较，＃P＜0.05；与刺激组比较，**P＜0.01。

3.2 委陵菜酸对PDGF-BB 刺激LX-2 细胞增殖的影响 与正常组比较，20 ng／mL PDGF-BB 促进LX-2 细胞的增殖（P＜0.01）；与刺激组比较，委陵菜酸和LY294002 对PDGF-BB 引起的细胞增殖具有抑制作用（P＜0.01），并呈剂量依赖性，见表3。

表3 委陵菜酸对PDGF-BB 刺激LX-2 细胞增殖的影响（， n＝5）

表3 委陵菜酸对PDGF-BB 刺激LX-2 细胞增殖的影响（， n＝5）

注：与正常组比较，＃＃P＜0.01；与刺激组比较，**P＜0.01。

3.3 委陵菜酸对PDGF-BB 刺激LX-2 细胞活化的影响 与正常组比较，PDGF-BB 刺激后LX-2 细胞Col-Ⅰ蛋白表达升高（P＜0.05），表明LX-2 细胞已被激活；与刺激组比较，委陵菜酸干预能抑制活化的LX-2 细胞Col-Ⅰ蛋白表达（P＜0.05，P＜0.01），且呈现剂量依赖性，见图1。与刺激组比较，委陵菜酸干预能抑制Col-Ⅰ和Col-ⅢmRNA 表达（P＜0.01），见表4。

表4 委陵菜酸对PDGF-BB 刺激LX-2 细胞Col-Ⅰ和Col-ⅢmRNA 表达的影响（， n＝3）

表4 委陵菜酸对PDGF-BB 刺激LX-2 细胞Col-Ⅰ和Col-ⅢmRNA 表达的影响（， n＝3）

注：与正常组比较，＃＃P＜0.01；与刺激组比较，**P＜0.01。

图1 委陵菜酸对PDGF-BB 激活的LX-2 细胞Col-Ⅰ蛋白表达的影响（， n＝3）

3.4 委陵菜酸对PDGF-BB 刺激LX-2 细胞迁移的影响 如图2、表5 所示，与正常组比较，刺激组LX-2 细胞迁移距离增加（P＜0.01），PDGF-BB 促进了LX-2 细胞的迁移；与刺激组比较，各给药组LX-2 细胞迁移距离缩短（P＜0.01），委陵菜酸对PDGF-BB 刺激LX-2 细胞迁移具有抑制作用，且呈剂量依赖性。

表5 委陵菜酸对PDGF-BB 刺激LX-2 细胞迁移的影响（， n＝3）

表5 委陵菜酸对PDGF-BB 刺激LX-2 细胞迁移的影响（， n＝3）

注：与正常组比较，＃＃P＜0.01；与刺激组比较，**P＜0.01。

图2 各组LX-2 细胞迁移的情况（×100）

3.5 委陵菜酸对PDGF-BB 刺激LX-2 细胞集落形成的影响 如图3、表6 所示，与正常组比较，PDGF-BB 促进了LX-2 细胞的集落形成（P＜0.01）；与刺激组比较，药物干预可抑制LX-2 细胞的集落形成（P＜0.01），其抑制率呈剂量依赖性。

图3 各组LX-2 细胞集落形成的情况

表6 委陵菜酸对PDGF-BB 刺激LX-2 细胞集落形成的影响（， n＝3）

表6 委陵菜酸对PDGF-BB 刺激LX-2 细胞集落形成的影响（， n＝3）

注：与正常组比较，＃＃P＜0.01；与刺激组比较，**P＜0.01。

3.6 委陵菜酸对PDGF-BB 刺激LX-2 细胞PI3K／Akt／mTOR信号通路蛋白表达的影响 如图4 所示，与正常组比较，PDGF-BB 刺激上调了LX-2 细胞p-Akt、p-PI3K、P70S6K、p-FAK、p-mTOR 蛋白表达（P＜0.05）；与刺激组比较，药物干预下调了LX-2 细胞p-Akt、p-PI3K、P70S6K、p-FAK、p-mTOR 蛋白表达（P＜0.01），且呈剂量依赖性。

图4 委陵菜酸对PDGF-BB 刺激LX-2 细胞PI3K／Akt／mTOR 信号通路蛋白表达的影响（， n＝3）

4 讨论

肝纤维化是各种慢性肝脏疾病向肝硬化发展的必经阶段［4］。HSCs 在肝纤维化过程中扮演着重要角色，其活化、增殖是肝纤维化形成的关键环节［12］。在正常情况下，HSCs处于静息状态，主要负责储存维生素A，当受到外界刺激时，细胞形态发生改变，胞内的维生素A 消失，HSCs 发生活化，转变成为肌成纤维样细胞［13］，活化的HSCs 增殖、迁移和收缩能力增强，以胶原为主的ECM 释放增加，导致肝纤维化的发生［5］。因此，抑制HSCs 细胞活化和减少细胞外基质的合成是逆转肝纤维化的关键。PDGF-BB 是对HSCs有效的激活剂，当肝脏受到刺激时，PDGF 被HSCs 以自分泌或旁分泌途径被释放，HSCs 的PDGF 受体被诱导至细胞表面，二者形成一个有效的正反馈环，不断激活HSCs［14］，同时PDGF 还可激活下游PI3K、ERK 和其他途径的信号传导，促进其增殖、迁移和分泌ECM［12］。通过PDGF-BB 刺激HSCs后，加入委陵菜酸24 h，发现LX-2 细胞增殖被抑制。提示委陵菜酸对活化的LX-2 细胞有抑制作用。

HSCs 活化后，增殖和迁移能力增强［14］。PDGF-BB 刺激后LX-2 细胞的增殖率和迁移率升高；LY294002 和委陵菜酸均能抑制LX-2 细胞的增殖和迁移，并呈剂量依赖性。提示委陵菜酸具有抑制LX-2 细胞增殖和迁移的能力。

HSCs 细胞表型发生转化后，合成ECM 的能力增加，大量Col-Ⅰ和Col-Ⅲ因溶解失衡而过度沉积，从而造成肝纤维化的发生［5］，胶原水平的高低可以反映肝纤维化程度。PDGF-BB 刺激后LX-2 细胞Col-Ⅰ表达增加，委陵菜酸干预能下调Col-I 蛋白表达，且可降低Col-Ⅰ和Col-ⅢmRNA 表达。提示委陵菜酸能抑制HSCs 的ECM 过度沉积及胶原的形成，从而达到抗肝纤维化的作用。

PI3K／Akt／mTOR 信号通路在促进细胞生长、增殖、分化，促进细胞运动、侵袭，抗凋亡以及肝纤维化的发展中发挥重要作用［9］。PI3K 是细胞生长信号通路中一个重要的激酶，当PDGF 与相应的配体结合后，能与PI3K 85 kDa 亚基结合，使其发生磷酸化活化［15］，磷酸化的PI3K 促进Akt聚集于细胞膜上并被活化，活化的Akt 可直接磷酸化mTOR致其激活，mTOR 激活后可通过下游核糖体S6 蛋白激酶通路调控细胞的生长和增殖［15］。细胞粘附斑激酶可作为PI3K／Akt／mTOR 信号通路上游刺激因子，调节细胞生长［8］。PDGF-BB 刺激24 h，LX-2 细胞中p-PI3K、p-Akt、pmTOR、p-FAK 蛋白表达上调，PI3K／Akt 通路被激活。委陵菜酸和LY294002 干预下调了细胞中p-PI3K、p-Akt、pmTOR、p-FAK 蛋白表达。提示委陵菜酸能够抑制HSCs 活化和增殖、减少胶原沉积，其机制可能与抑制PI3K／Akt／mTOR 信号通路有关。

综上所述，委陵菜酸可通过PI3K／Akt／mTOR 信号途径有效抑制HSCs 活化，起到抗纤维化的作用。