京尼平苷通过调节Perilipin-2 表达对肝细胞脂滴形成的影响

徐星科 边阳萍 赵婉均王秋惠殷菲*

（1.重庆理工大学药物化学与分子药理学重庆市重点实验室，重庆400054； 2.重庆理工大学药学与生物工程学院，重庆400054）

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一种肝脏脂质积累性疾病，主要表现为单纯的肝脏脂肪变性或非酒精性脂肪性肝炎［1］。研究表明，富含甘油三酯（triglycerides，TG）的脂滴异常累积是导致NAFLD 的重要机制［2］。

中药栀子是一种药食两用的植物，具有多种药理学作用［3-4］。近年来，国内外学者研究表明，栀子主要活性成分京尼平苷可降低血清中谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）和谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）水平，影响脂质代谢，改善糖尿病小鼠肝组织炎症，并通过调节肠道菌群和炎症因子水平等改善NAFLD 症状，在保肝和肝病防治中具有广阔的应用前景［5-10］。

本课题组前期研究发现，京尼平苷是一种选择性胰高血糖素样肽1（glucagon-like peptide 1，GLP-1）受体激动剂，可通过激活GLP-1 受体调节胰腺β 细胞对葡萄糖的吸收和代谢，影响胰岛素分泌［11-15］。目前尚不清楚京尼平苷是如何影响肝细胞脂滴的形成，因此，本研究分别在饱和脂肪酸油酸诱导的肝细胞和ob／ob 小鼠动物模型上考察京尼平苷对脂滴形成的影响。

1 材料

1.1 细胞与动物 人源HepG2 肝细胞，购自美国ATCC库，在含10%胎牛血清和1%青霉素／链霉素（P／S）的DMEM 培养基中，于37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养。10 只雄性8～10 周龄C57BL／6 小鼠、20 只ob／ob 小鼠购自北京华阜康生物科技股份有限公司，实验动物生产许可证号SCXK（京）2019-0008，饲养于重庆医科大学实验动物中心，在12 h／12 h 光照／黑暗、温度（25±2）℃，相对湿度50%～60%，自由进食饮水的环境中适应性喂养1 周后进行实验。动物实验经重庆理工大学实验动物伦理委员会审查通过［批准文号（2019）研审第（201918）号］。

1.2 试剂与药物 京尼平苷购自北京生物制品研究所有限责任公司。DMEM 细胞基础培养基、蛋白酶抑制剂、RIPA 裂解液购自美国Sigma 公司；胎牛血清购自美国HyClone 公司；胰酶、青霉、链霉素购自生工生物工程（上海）股份有限公司；Tris、Glycine 购自美国Genview 公司；Prililipin-2抗体购自美国Proteintech 公司；β-actin 抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司；ECL 发光底物购自美国Millipore 公司；BCA 蛋白浓度检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；总RNA 提取试剂盒、PCR 相关试剂盒购自美国Bio-Rad公司。

2 方法

2.1 分组与给药 将20 只ob／ob 小鼠随机分为模型组和京尼平苷组，每组10只，10 只同月龄C57BL／6 小鼠作为对照组。京尼平苷组每天灌胃给予20 mg／kg 京尼平苷，模型组及对照组灌胃等体积蒸馏水，每天1次，连续4 周。

2.2 葡萄糖耐量检测 小鼠灌胃给药4 周后禁食14 h，记录体质量，每只按照2.5 g／kg 剂量灌胃给予葡萄糖，分别在给糖前（0 min）和给糖后15、30、60、120 min 尾静脉采血，血糖仪检测血糖水平，绘制糖耐量曲线，计算曲线下面积。

2.3 甘油三酯、总胆固醇水平检测 采集小鼠全血，静置0.5 h，4 ℃、3 000 r／min 离心15 min，吸取上层血清，采用Vitros-250 化学分析仪检测血清甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）水平。

2.4 HE 染色 将小鼠肝组织进行固定，经脱水、包埋、切片后用蒸馏水润洗1～2次，苏木素染色1～2 s，流水洗去苏木素染液，1%盐酸乙醇溶液分化3～5 s，流水清洗5～10 s，碱水返蓝20 s，流水清洗5～10 s，伊红染色30～60 s，蒸馏水漂洗3～5 s，经80%乙醇1～2 s、95%乙醇1～2 s、无水乙醇1～2 s、二甲苯（Ⅰ）2～3 s、二甲苯（Ⅱ）2～3 s 处理后中性树胶封片，在倒置显微镜下观察。

2.5 油红O 染色 将HepG2 细胞随机分为对照组、模型组、京尼平苷组，模型组、京尼平苷组用0.6 mmol／L 油酸进行诱导，对照组不作任何处理，处理8 h 后京尼平苷组加入10 μmol／L 该成分，对照组、模型组加入DMEM 培养基，处理24 h 后将各组细胞爬片用PBS 漂洗2次，4%多聚甲醛固定10 min，PBS 漂洗3次，60%异丙醇处理2 min，油红O 工作液染色20 min，弃去染色液，在倒置显微镜下观察。

2.6 RT-qPCR 法检测Perilipin-2 mRNA 表达 采用RNA 提取试剂盒提取各组细胞或肝组织总RNA，定量后取1 μg，iScript cDNA 合成试剂盒进行逆转录，反应条件为25 ℃5 min，42 ℃30 min，85 ℃5 min，4 ℃保持，反应结束后在-20 ℃下保存，SYBR PCR MASTER MIX 试剂盒检测Perilipin-2 mRNA 表达，反应条件为95 ℃变性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共40 个循环，以βactin为参照基因，2-ΔΔCT法计算目的基因相对表达，并对数据进行归一化处理。β-actin正向引物序列为5′-GCAAGTGCTTCTAGGCGGAC-3′，反向引物序列为5′-AAGAAAGGGTGTAAAACGCAGC-3′；人Perilipin-2 基因正向引物序列为 5′-TTGCAGTTGCCAATACCTATGC-3′，反向引物序列为 5′-CCAGTCACAGTAGTCGTCACA-3′；小鼠Perilipin-2 基因正向引物序列为 5′-TGGTGAGTGGCCTGTGTTAG-3′，反向引物序列为5′-GCACACGCCTTGAGAGAAAC-3′。

2.7 Western blot 法检测目的蛋白表达 使用RIAP 裂解液裂解细胞或肝组织，离心收集上清，得总蛋白，BCA 法定量后取20～30 μg 上样，10%SDS-PAGE 电泳后转移到PVDF 膜上，加入5% 脱脂奶粉室温封闭2 h，加入一抗Perilipin-2（1∶2 000），在4 ℃下孵育过夜，TBST 漂洗3次，每次15 min，加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶10 000）孵育1 h，TBST 漂洗3次，每次15 min，ECL 试剂显影、成像，采用Image J 软件分析条带灰度值，以GAPDH 为内参，计算Perilipin-2 蛋白相对表达。

2.8 统计学分析 通过Origin 8.0 软件进行处理，数据以（）表示，2 组间比较采用Student’st检验，多项比较采用单因素方差分析和Bonferroni检验。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 京尼平苷对ob／ob 小鼠体质量、葡萄糖耐量及血清TG、TC 水平的影响 如图1 所示，与对照组比较，模型组ob／ob 小鼠体质量增加（P＜0.01），葡萄糖耐量降低（P＜0.05），血清TG、TC 水平均升高（P＜0.01）；与模型组比较，京尼平苷组ob／ob 小鼠体质量减轻（P＜0.05），葡萄糖耐量升高（P＜0.05），血清TG、TC 水平均降低（P＜0.01）。

图1 京尼平苷对ob／ob 小鼠体质量、葡萄糖耐量及血清TG、TC 水平的影响（， n＝10）Fig.1 Effects of geniposide on the body weight，glucose tolerance，and serum TG and TC levels in ob／ob mice（， n＝10）

3.2 京尼平苷对ob／ob 小鼠肝组织中脂滴形成的影响 如图2 所示，与对照组比较，模型组ob／ob小鼠肝组织呈现大量的空泡，呈明显脂肪变性，脂滴数量和大小均增加；与模型组比较，京尼平苷组ob／ob 小鼠肝组织中的空泡减少，脂肪变性得到改善，组织更加致密，脂滴数量和大小均减少。

图2 京尼平苷对ob／ob 小鼠肝组织中脂滴的影响Fig.2 Effect of geniposide on lipid droplets in liver tissue of ob／ob mice

3.3 京尼平苷对ob／ob 小鼠肝组织中Perilipin-2表达的影响 如图3 所示，与对照组比较，模型组ob／ob 小鼠肝组织中Perilipin-2 mRNA 和蛋白表达均升高（P＜0.01）；与模型组比较，京尼平苷组ob／ob 小鼠肝组织中Perilipin-2 mRNA 和蛋白表达均降低（P＜0.05）。

图3 京尼平苷对ob／ob 小鼠肝组织中Perilipin-2 mRNA（A）和蛋白（B）表达的影响（， n＝3）Fig.3 Effects of geniposide on hepatic mRNA（A）and protein（B）expressions of Perilipin-2 in ob／ob mice（， n＝3）

3.4 京尼平苷对油酸诱导的HepG2 细胞中脂滴形成的影响 如图4 所示，油酸处理可明显诱导HepG2 细胞中脂滴的形成，而京尼平苷干预后可明显抑制油酸诱导的HepG2 细胞中脂滴的积累。

图4 京尼平苷对油酸诱导的HepG2 细胞中脂滴形成的影响Fig.4 Effects of geniposide on lipid droplet formation in oleic acid-induced HepG2 cells

3.5 京尼平苷对油酸诱导HepG2 细胞中Perilipin-2 表达的影响 如图5 所示，与对照组（不含京尼平苷和油酸）比较，油酸诱导可增加HepG2 细胞中Perilipin-2 mRNA 和蛋白表达（P＜0.01）；与模型组（0.6 mmol／L 油酸）比较，京尼平苷干预后可降低油酸诱导的HepG2 细胞中Perilipin-2 的mRNA 和蛋白表达（P＜0.05，P＜0.01）。

图5 京尼平苷对油酸诱导的HepG2 细胞中Perilipin-2 mRNA（A）和蛋白（B）表达的影响（， n＝3）Fig.5 Effects of geniposide on mRNA（A）and protein（B）expressions of Perilipin-2 in oleic acid-induced HepG2 cells（， n＝3）

4 讨论

Perilipin-2 是一种脂肪细胞因子，属于PAT 家族蛋白成员，位于多种细胞的脂滴表面，是脂滴的主要成分之一，主要在分化的脂肪细胞中表达，在脂质运输、脂滴形成和贮存中起重要作用［16］。本实验结果表明，京尼平苷可降低ob／ob 小鼠体质量，改善胰岛素抵抗，降低血清中TG、TC 水平，同时还可减少肝脏中脂滴的积累和脂滴相关蛋白Perilipin-2 的表达，并在体外抑制油酸诱导的HepG2 细胞中脂滴的积累和Perilipin-2 表达。提示，京尼平苷可能在防止肥胖和过量饱和脂肪酸摄入引起的NAFLD 中发挥一定的作用。

脂滴是一种亚细胞结构，由中心的中性脂质如TG、胆固醇酯和周围包裹的磷脂单分子层所构成，其生命周期始于脂肪酸及胆固醇酯。在众多调节脂滴形成和分解的分子中，脂滴表面磷脂中镶嵌的Perilipin 对于脂滴的代谢及调节具有重要作用［17-19］。研究表明，在NAFLD中，Perilipin-2 蛋白普遍存在于肝细胞和肝星状细胞，包裹在脂滴周围，在所有Perilipin 蛋白中上调最为明显［20］。Perilipin-2 会促进TG 积累，抑制肝脏脂质分解，促进高脂食物诱导的NAFLD 症状［21-22］。本研究发现，京尼平苷在调节Perilipin-2 表达的同时抑制脂滴形成。提示，调节Perilipin-2 表达可能是京尼平苷减少脂滴积累，进而改善NAFLD 症状的重要途径。

由于NAFLD 是一种与胰岛素抵抗和遗传易感密切相关的代谢应激性肝脏损伤，因此，首要治疗目标是改善胰岛素抵抗，防治代谢综合征及其相关终末期器官病变，目前临床上尚缺乏安全有效的药物。GLP-1 受体激动剂是NAFLD 在研药物中极有发展前景的一类［23］。肝细胞上普遍表达GLP-1 受体，GLP-1 受体激动剂可直接调节肝脏脂质代谢、抑制炎性反应来保护肝细胞［24-25］。本课题组前期研究发现，京尼平苷是一种选择性GLP-1 受体激动剂，不仅可通过激活GLP-1 受体发挥抗氧化和抗炎作用［11，26］，还能调节胰腺β 细胞对葡萄糖的吸收和代谢，影响分泌胰岛素，拮抗高糖和高脂诱导的胰腺β 细胞损伤［13-14，27-30］。本研究发现，京尼平苷能在体内外降低肝细胞中脂滴的数量和大小。尽管京尼平苷调节脂滴形成的分子机制还有待于进一步深入研究，但综合国内外研究进展和本研究结果，京尼平苷可能在NAFLD 的防治中具有广阔的应用前景。