APP下载

抑制Rictor 对脓毒症小鼠心肌自噬水平的影响

2022-07-22蒋万威杨国辉

中国医药导报 2022年18期
关键词:盲肠脓毒症心肌细胞

蒋万威 杨国辉

贵州医科大学临床医学院,贵州贵阳 550004

心脏是脓毒症常见的靶器官,超过1/4 的脓毒症 心肌损伤患者在28 d 内死亡[1-2]。超过10%的患者可进一步发展为脓毒症性心肌病,长期影响患者的心脏功能[3-4]。自噬作为机体在应激时的保护机制之一,可清除受损细胞器或病原体,处于多种稳态途径的十字路口[5-6]。PI3K/Akt/mTOR 信号通路是自噬的主要调控通路之一,其表达水平的上调可抑制自噬。本研究利用盲肠结扎穿孔术(cecum ligation and puncture,CLP)建立脓毒症急性心肌损伤小鼠模型,使用雷帕霉素不敏感的Rictor 特异性抑制剂干预,研究脓毒症时Rictor 对心肌细胞自噬的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康雄性SPF 级昆明种小鼠36 只,6~7 周龄,体重40~60 g,购于贵州医科大学实验动物中心[许可证号:SYXK(黔)2018-0001,合格证:110324210104222 683],实验操作符合动物伦理要求(2001133)。

1.2 实验试剂及仪器

主要实验试剂:Rictor 抑制剂JR-AB2-011(美国Aobious 公司,批号:AOB31722);LC3B 抗体、Akt(pan)抗体、磷酸化Akt(phospho-Aktser473)抗体、Rictor 抗体(美国CST 公司,批号:#2775、#4685S、# 4071S、#9476S);Raptor 抗体、GAPDH 抗体(美国Bioword 公司,批号:AP1001、BS65483M)。

主要实验仪器:蛋白电泳及转印系统(美国BIORAD 公司,型号:Mini-PROTEAN);化学发光成像系统(美国Syngene 公司,型号GeneGnome XRQ);全自动生化仪(美国Abbott 公司,型号:ARCHITECT 8000)。

1.3 实验方法

1.3.1 动物模型及实验分组 采用随机数字表法将小鼠分为假手术组、模型组、实验组,每组12 只。术前禁食12 h,不禁饮。使用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,腹部正中逐层切开暴露盲肠。模型组及实验组在盲肠远端1/2 处结扎,并用7 号针头于不同部位贯穿两次,挤压穿孔部位使肠内容物溢出少许,还纳盲肠并逐层缝合;假手术组暴露盲肠后直接还纳。术后实验组给予JR-AB2-011 10 mg/kg 腹腔注射[7],假手术组及模型组给予同等剂量的生理盐水。造模成功标准:小鼠CLP 术后苏醒延迟、反应迟钝、精神萎靡、活动明显减少,进食、进饮减少,呼吸频率加快;剖腹可见恶臭味血性渗液,肠管水肿粘连,盲肠结扎远端坏死变黑。

1.3.2 标本收集 术后12 h 及24 h 分别取各组6 只小鼠,麻醉后腹主动脉采血0.3 ml,开胸摘取小鼠心脏。全血分离血清后-80℃保存,取心尖组织进行蛋白表达水平检测及组织形态学检测。

1.3.3 心肌损伤标志物检测 使用全自动生化分析仪检测血清心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I,cTnI)及肌酸激酶同工酶(creatine kinase MB,CK-MB)水平。

1.3.4 心肌组织相关蛋白检测 使用SDS 提取小鼠心肌组织蛋白,利用蛋白凝胶电泳及湿转法将目的蛋白转印至PVDF 膜,5%脱脂奶粉封闭2 h,使用Rictor(1∶1000)、panAkt(1∶1000)、Phospho-Aktser473(1∶2000)、Raptor(1∶1000)、LC3B(1∶1000)、GAPDH(1∶5000)4℃孵育过夜。对应二抗室温孵育1 h 后显影。

1.3.5 心肌组织病理学检查 取小鼠心尖组织,于10%甲醛及2.5%戊二醛固定,前者使用HE 染色后扫描电镜下观察,后者于透射电镜下观察。

1.4 统计学方法

采用SPSS 23.0 统计学软件进行数据分析,计量资料用均数±标准差()表示,比较采用t 检验;计数资料用例数表示。以P <0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组cTnI、CK-MB 水平比较

模型组各时间点cTnI、CK-MB 水平高于假手术组;实验组各时间点cTnI、CK-MB 水平低于模型组,差异有统计学意义(P <0.05)。见表1。

表1 各组cTnI、CK-MB 水平比较()

表1 各组cTnI、CK-MB 水平比较()

注 与假手术组同期比较,aP <0.05;与模型组同期比较,bP <0.05。cTnI:心肌肌钙蛋白I;CK-MB:肌酸激酶同工酶

2.2 各组心肌组织蛋白表达水平比较

模型组各时间点Rictor、Phospho-AKTser473、Raptor 高于假手术组;术后12 h,模型组LC3B 高于假手术组,差异有统计学意义(P <0.05)。实验组各时间点Rictor、Phospho-AKTser473、Raptor 低于模型组,LC3B 高于模型组,差异有统计学意义(P <0.05)。见图1、表2。

表2 各组心肌组织蛋白表达水平比较()

表2 各组心肌组织蛋白表达水平比较()

注 与假手术组同期比较,aP <0.05;与模型组同期比较,bP <0.05

2.3 各组心肌组织形态学观察

假手术组心肌组织排列正常;模型组可见心肌纤维中度水样变性;实验组可见少量心肌纤维水样变性,细胞肿胀(图2A)。透射电镜下,模型组及实验组均可观察到自噬体及自噬溶酶,后者更为显著(图2B)。

3 讨论

脓毒症强烈的免疫和炎症反应,直接诱导了心肌细胞损伤的发生,进一步发展为脓毒症心功能障碍,是患者死亡的重要原因之一[8]。高达50%的脓毒症休克患者合并脓毒症心功能障碍,早期出现的心肌细胞损伤和心功能障碍,常提示患者的预后不良[9-10]。除脓毒症本身所致的心肌损伤外,还包括并发的低氧血症、酸中毒、代谢紊乱及免疫系统功能异常等多方面因素,共同构成了心肌细胞复杂的损伤机制[11-13]。cTn水平升高常提示心肌细胞损伤,可用以判断脓毒症患者心肌损伤程度及预后[14]。本研究结果显示,脓毒症小鼠血清cTnI、CK-MB 水平在早期即明显升高,提示心肌细胞损伤的发生。

自噬作为机体的保护机制之一,参与受损细胞及细胞器的修复、回收、再利用等过程,减轻组织器官的损伤;自噬在脓毒症中起到保护心肌细胞及清除受损细胞器的作用,自噬不足会引起心肌细胞损伤的增加[15-16]。当病原微生物入侵机体后,多个自噬信号通路被激活,从而增强自噬水平,减轻炎症反应的强度,并改善及控制感染[17-18]。PI3K/Akt/mTOR 作为自噬抑制通路在脓毒症患者中表达水平升高,抑制自噬水平,限制了组织器官的自我修复[19-20]。

脓毒症合并心肌损伤患者自噬水平更低,心肌细胞损伤显著,其潜在机制可能是通过mTOR 的调控实现的[1,21]。当脓毒症发生后,胰岛素样生长因子通过PI3K 活化mTORC2[22],Rictor 作为其关键组成部分,活化Akt 并增强mTORC1 的表达水平,发挥自噬负调控作用[23-25]。本研究结果显示,该信号通路在小鼠心肌组织中被激活,Rictor 表达升高,Akt 磷酸化增加,限制了LC3B 的活化、抑制自噬;通过抑制Rictor 的表达,LC3B 的表达水平明显提高,自噬小体及自噬溶酶体增多,心肌酶下降,体现了自噬对心肌细胞的保护作用。

综上所述,脓毒症中自噬水平的不足加剧了心肌细胞损伤的程度,通过抑制Rictor 可提高心肌细胞的自噬水平,有利于清除受损的细胞器,减少坏死及凋亡的发生,从而减轻因脓毒症导致的心肌细胞损伤。

猜你喜欢

盲肠脓毒症心肌细胞
左归降糖舒心方对糖尿病心肌病MKR鼠心肌细胞损伤和凋亡的影响
活血解毒方对缺氧/复氧所致心肌细胞凋亡的影响
鸡盲肠肝炎的流行病学、临床特征、实验室检查和防治措施
血清IL-6、APC、CRP在脓毒症患者中的表达及临床意义
脓毒症的病因病机及中医治疗进展
心肌细胞慢性缺氧适应性反应的研究进展
大鼠盲肠结扎穿刺脓毒症模型死亡率影响因素研究
脓毒症早期诊断标志物的回顾及研究进展
采用Illumina MiSeq测序技术分析断奶幼兔盲肠微生物群落的多样性
槲皮素通过抑制蛋白酶体活性减轻心肌细胞肥大