抑制Rictor 对脓毒症小鼠心肌自噬水平的影响

蒋万威 杨国辉

贵州医科大学临床医学院，贵州贵阳 550004

心脏是脓毒症常见的靶器官，超过1/4 的脓毒症 心肌损伤患者在28 d 内死亡[1-2]。超过10%的患者可进一步发展为脓毒症性心肌病，长期影响患者的心脏功能[3-4]。自噬作为机体在应激时的保护机制之一，可清除受损细胞器或病原体，处于多种稳态途径的十字路口[5-6]。PI3K/Akt/mTOR 信号通路是自噬的主要调控通路之一，其表达水平的上调可抑制自噬。本研究利用盲肠结扎穿孔术（cecum ligation and puncture，CLP）建立脓毒症急性心肌损伤小鼠模型，使用雷帕霉素不敏感的Rictor 特异性抑制剂干预，研究脓毒症时Rictor 对心肌细胞自噬的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康雄性SPF 级昆明种小鼠36 只，6～7 周龄，体重40～60 g，购于贵州医科大学实验动物中心[许可证号：SYXK（黔）2018-0001，合格证：110324210104222 683]，实验操作符合动物伦理要求（2001133）。

1.2 实验试剂及仪器

主要实验试剂：Rictor 抑制剂JR-AB2-011（美国Aobious 公司，批号：AOB31722）；LC3B 抗体、Akt（pan）抗体、磷酸化Akt（phospho-Aktser473）抗体、Rictor 抗体（美国CST 公司，批号：#2775、#4685S、# 4071S、#9476S）；Raptor 抗体、GAPDH 抗体（美国Bioword 公司，批号：AP1001、BS65483M）。

主要实验仪器：蛋白电泳及转印系统（美国BIORAD 公司，型号：Mini-PROTEAN）；化学发光成像系统（美国Syngene 公司，型号GeneGnome XRQ）；全自动生化仪（美国Abbott 公司，型号：ARCHITECT 8000）。

1.3 实验方法

1.3.1 动物模型及实验分组 采用随机数字表法将小鼠分为假手术组、模型组、实验组，每组12 只。术前禁食12 h，不禁饮。使用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，腹部正中逐层切开暴露盲肠。模型组及实验组在盲肠远端1/2 处结扎，并用7 号针头于不同部位贯穿两次，挤压穿孔部位使肠内容物溢出少许，还纳盲肠并逐层缝合；假手术组暴露盲肠后直接还纳。术后实验组给予JR-AB2-011 10 mg/kg 腹腔注射[7]，假手术组及模型组给予同等剂量的生理盐水。造模成功标准：小鼠CLP 术后苏醒延迟、反应迟钝、精神萎靡、活动明显减少，进食、进饮减少，呼吸频率加快；剖腹可见恶臭味血性渗液，肠管水肿粘连，盲肠结扎远端坏死变黑。

1.3.2 标本收集 术后12 h 及24 h 分别取各组6 只小鼠，麻醉后腹主动脉采血0.3 ml，开胸摘取小鼠心脏。全血分离血清后-80℃保存，取心尖组织进行蛋白表达水平检测及组织形态学检测。

1.3.3 心肌损伤标志物检测 使用全自动生化分析仪检测血清心肌肌钙蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）及肌酸激酶同工酶（creatine kinase MB，CK-MB）水平。

1.3.4 心肌组织相关蛋白检测 使用SDS 提取小鼠心肌组织蛋白，利用蛋白凝胶电泳及湿转法将目的蛋白转印至PVDF 膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，使用Rictor（1∶1000）、panAkt（1∶1000）、Phospho-Aktser473（1∶2000）、Raptor（1∶1000）、LC3B（1∶1000）、GAPDH（1∶5000）4℃孵育过夜。对应二抗室温孵育1 h 后显影。

1.3.5 心肌组织病理学检查 取小鼠心尖组织，于10%甲醛及2.5%戊二醛固定，前者使用HE 染色后扫描电镜下观察，后者于透射电镜下观察。

1.4 统计学方法

采用SPSS 23.0 统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（）表示，比较采用t 检验；计数资料用例数表示。以P <0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组cTnI、CK-MB 水平比较

模型组各时间点cTnI、CK-MB 水平高于假手术组；实验组各时间点cTnI、CK-MB 水平低于模型组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见表1。

表1 各组cTnI、CK-MB 水平比较（）

表1 各组cTnI、CK-MB 水平比较（）

注 与假手术组同期比较，aP ＜0.05；与模型组同期比较，bP ＜0.05。cTnI：心肌肌钙蛋白I；CK-MB：肌酸激酶同工酶

2.2 各组心肌组织蛋白表达水平比较

模型组各时间点Rictor、Phospho-AKTser473、Raptor 高于假手术组；术后12 h，模型组LC3B 高于假手术组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。实验组各时间点Rictor、Phospho-AKTser473、Raptor 低于模型组，LC3B 高于模型组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见图1、表2。

表2 各组心肌组织蛋白表达水平比较（）

表2 各组心肌组织蛋白表达水平比较（）

注 与假手术组同期比较，aP ＜0.05；与模型组同期比较，bP ＜0.05

2.3 各组心肌组织形态学观察

假手术组心肌组织排列正常；模型组可见心肌纤维中度水样变性；实验组可见少量心肌纤维水样变性，细胞肿胀（图2A）。透射电镜下，模型组及实验组均可观察到自噬体及自噬溶酶，后者更为显著（图2B）。

3 讨论

脓毒症强烈的免疫和炎症反应，直接诱导了心肌细胞损伤的发生，进一步发展为脓毒症心功能障碍，是患者死亡的重要原因之一[8]。高达50%的脓毒症休克患者合并脓毒症心功能障碍，早期出现的心肌细胞损伤和心功能障碍，常提示患者的预后不良[9-10]。除脓毒症本身所致的心肌损伤外，还包括并发的低氧血症、酸中毒、代谢紊乱及免疫系统功能异常等多方面因素，共同构成了心肌细胞复杂的损伤机制[11-13]。cTn水平升高常提示心肌细胞损伤，可用以判断脓毒症患者心肌损伤程度及预后[14]。本研究结果显示，脓毒症小鼠血清cTnI、CK-MB 水平在早期即明显升高，提示心肌细胞损伤的发生。

自噬作为机体的保护机制之一，参与受损细胞及细胞器的修复、回收、再利用等过程，减轻组织器官的损伤；自噬在脓毒症中起到保护心肌细胞及清除受损细胞器的作用，自噬不足会引起心肌细胞损伤的增加[15-16]。当病原微生物入侵机体后，多个自噬信号通路被激活，从而增强自噬水平，减轻炎症反应的强度，并改善及控制感染[17-18]。PI3K/Akt/mTOR 作为自噬抑制通路在脓毒症患者中表达水平升高，抑制自噬水平，限制了组织器官的自我修复[19-20]。

脓毒症合并心肌损伤患者自噬水平更低，心肌细胞损伤显著，其潜在机制可能是通过mTOR 的调控实现的[1,21]。当脓毒症发生后，胰岛素样生长因子通过PI3K 活化mTORC2[22]，Rictor 作为其关键组成部分，活化Akt 并增强mTORC1 的表达水平，发挥自噬负调控作用[23-25]。本研究结果显示，该信号通路在小鼠心肌组织中被激活，Rictor 表达升高，Akt 磷酸化增加，限制了LC3B 的活化、抑制自噬；通过抑制Rictor 的表达，LC3B 的表达水平明显提高，自噬小体及自噬溶酶体增多，心肌酶下降，体现了自噬对心肌细胞的保护作用。

综上所述，脓毒症中自噬水平的不足加剧了心肌细胞损伤的程度，通过抑制Rictor 可提高心肌细胞的自噬水平，有利于清除受损的细胞器，减少坏死及凋亡的发生，从而减轻因脓毒症导致的心肌细胞损伤。