结直肠腺瘤的肠道微生态分析及临床意义

徐 俊 陈冰心 朱永亮 奚沁华 严 苏

1.苏州大学附属第一医院消化内科，江苏苏州 215006；2.苏州普瑞森基因有限公司，江苏苏州 215000

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是西方世界癌症相关的第二大死因[1]；在我国，CRC 是第三大常见癌症，第五大死亡原因[2]。CRC 通常起源于结直肠腺瘤（colorectal adenoma，CRA）[3]，随着APC 基因的丢失以及KRAS、TP53 等基因激活和失活突变的累积，最终导致肿瘤发生[4]。目前认为在经典的腺瘤—癌发展进程中，CRA 患者存在明显的肠道菌群失衡现象[5-6]，其发生是涉及多个细菌类群组成改变的复杂过程。如能将这种复杂的变化提炼为一个简单的指标，将有助于推动肠道菌群研究的临床应用。

目前临床缺乏对CRA 非侵入性安全高效的早期检测手段[7]。本研究拟运用16S rRNA 高通量测序技术及生物信息学分析方法，观察CRA 患者和健康志愿者肠道菌群组成差异并以此构建模型，为发展CRA 早期诊断标志物提供新的思路及理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2017 年1 月至2018 年7 月在苏州大学附属第一医院行肠镜检查的96 例CRA 患者。纳入标准：①年龄≥18 周岁；②在苏州地区居住满5 年以上；③肠镜和病理学结果明确。排除标准：①既往有结直肠手术史；②近1 个月使用过非甾体类抗炎药、抗生素、类固醇皮质激素及益生菌；③有肠道感染、肠功能紊乱、炎症性肠病、代谢性疾病（糖尿病、肥胖、高脂血症）、严重肝肾疾病及免疫缺陷；④有特殊饮食习惯（高脂肪、高蛋白、低膳食纤维）或饮食限制。同期以相同排除标准纳入59 名肠镜未见异常的健康体检者作为对照组。所有志愿者于肠道准备前留取粪便样本，并进行粪便隐血试验（fecal occult blood test，FOBT）和血清癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）检测。两组一般资料比较，差异无统计学意义（P ＞0.05），具有可比性，见表1。本研究通过苏州大学附属第一医院伦理委员会审核[批准号+56（2016）]，每位受试者签署知情同意书。

表1 两组一般资料比较

1.2 研究方法

使用TIANamp 粪便DNA 试剂盒（天根生化科技有限公司，货号：DP328）进行粪便DNA 提取。使用NanoDrop 2000c 分光光度计（赛默飞世尔科技公司）对纯化核酸进行定量。通过PCR 技术对细菌16S V3-V4区域扩增，所用引物为：16SF_V3：5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT-3’和16SR_V4：5’-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGGACTACNVGGGTWTCTAATC-3’。将PCR 产物在Illumina Miseq测序平台进行双端测序分析。

使用PANDAseq（v0.21.1）拼接V3-V4 序列，用Trimmomatic（V0.30）进行质量过滤。通过Vsearch（v1.9.6）去除序列中的嵌合体。按97%相似度进行out群落聚类。通过Cytoscape 将丰度差异菌属构建网络关系图。使用R 中的随机森林分类系统训练OTU 预测患者风险。

基于差异菌株构建加权失衡指数（weighted dysbiosis index，WDI）模型，WDI 定义为样本到健康组质心欧式距离（μN）与样本到疾病组质心欧式距离（μD）的差值，即WDIs（S，μD，μN）=，其 中Si，μDi，μNi 分别代表样本S、μN、μD 第i 类群丰度，FCi 是第i 类群倍数变化。WDI 正值代表测试样本远离健康组距离超过疾病组，处于失衡状态。

1.3 统计学方法

采用SPSS 21.0 统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（）表示，两组间比较采用t 检验；计数资料用例数或百分率表示，组间比较采用χ2检验；绘制受试者操作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线，观察不同检测方法对CRA 的诊断效能。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组基本特征比较

每个样本平均可获得110 000 条序列，序列平均长度为453.7 bp。两组ACE、Chao1、Shannon 和Simpson指数比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）；两组序列数、序列长度比较，差异无统计学意义（t=0.11、0.32，P=0.92、0.76）。见图1。

图1 两组基本特征比较

2.2 两组菌群组成比较

与对照组比较，CRA 组肺炎克雷伯菌、粪副拟杆菌、梭杆菌属丰度增加；放线菌门、毛螺菌科、布劳特氏菌属、双歧杆菌属、罗氏杆菌属、链球菌属、假丁酸弧菌属、溃疡梭杆菌种丰度减少。见图2。

图2 两组菌群组成比较

2.3 多种检测方法对CRA 的诊断效能

FOBT 诊断CRA 的灵敏度为15.63%（15/96），特异度为91.53%（54/59），误诊率为8.47%（5/59），漏诊率为84.38%（81/96）。WDI 诊断CRA 的灵敏度为83.33%，特异度为71.19%，曲线下面积（area under the curve，AUC）为0.795（P ＜0.0001，95%CI：0.712～0.877）；CEA诊断CRA 的灵敏度为71.88%，特异度为52.54%，AUC为0.614（P=0.017，95%CI：0.523～0.706）。见图3。

图3 基于WDI 和CEA 的ROC 曲线

3 讨论

本研究运用高通量测序比较CRA 组和对照组肠道菌群组成，显示CRA 阶段存在明显的菌群失衡现象。与临床常用的FOBT 和CEA 比较，基于11 个丰度差异类群构建的WDI 模型在CRA 诊断中具有更为优秀的效能。

研究表明，CRA 患者肺炎克雷伯菌丰度高于对照组[8]，而粪副拟杆菌在进展期腺瘤中明显富集[9]。腺瘤中梭杆菌属丰度与局部炎症呈正相关，而与腺瘤大小或数量无明显相关性[10]。毛螺菌可减少肠道息肉的发生[11]，其在CRA 组的丰度低于对照组[12]。双歧杆菌可以降低结肠pH、抑制潜在的病原体[13]。Rezasoltani等[14]发现，CRA 组双歧杆菌、罗氏杆菌明显减少，且息肉越大、分化越差、丰度降低越明显。此外，CRA 患者布劳特菌属的丰度也是下降的[15]，该菌还涉及代谢相关疾病[16]。假丁酸弧菌属和溃疡梭杆菌同为产丁酸盐类细菌[17]。丁酸盐具有抑制结肠炎症和癌变的作用，本研究中上述类群在CRA 组的缺失与发病机制的联系还有待进一步研究。

大规模人群筛查是降低结直肠肿瘤发病率的重要途径[18]。现有的方法包括：FOBT、血清CEA、粪便DNA、胶囊内镜、气钡双重造影、CT、结肠镜等[19]，但往往存在依赖先进设备、检查费用昂贵、放射性危害、对腺瘤检出率不高等问题[20-23]。有报道，FOBT 对CRA 的诊断敏感度为47.7%[24]，而CEA 的敏感度仅为11%～18%[25]，缺乏参考价值。本研究构建的模型对于CRA的诊断潜能明显优于这两者。鉴于肠道菌群模型只需采集患者粪便，无创便捷，在扩大样本量寻找更具代表性的菌株优化模型基础上，或许有望将其发展为CRA 早期筛查的一种新手段。