环丝氨酸联合利福平和异烟肼对耐药结核分枝杆菌体外作用效果的研究

陈胜杰 李 溪 李 超

1.广州中医药大学第一附属医院检验科，广东广州 510405；2.广东省佛山市妇幼保健院中心实验室，广东佛山 528000

根据世界卫生组织2019 年全球结核病的最新报告，全球潜伏性结核感染人群接近20 亿，新发结核病患者996 万例[1]。我国是全球结核病高负担国家之一，结核病的防控仍然十分严峻[2]。由于耐药结核分枝杆菌的产生及其引起的耐多药结核病的持续流行，一线抗结核药物已不能满足临床的治疗需求[3-4]。开展潜在有效抗结核药物十分重要[5-6]。环丝氨酸（D-Cycloserine，DCS）是广谱二线抗结核药物，能够抑制结核分枝杆菌生长，是代表性潜在药物[7-8]。2011 年世界卫生组织已推荐将DCS 用于耐多药结核病的治疗[9]。近年，伊朗、南非等国家采用DCS 治疗耐多药结核病取得了较好的效果[10-11]。同时，联合药敏试验能够评估药物联合作用时的抑菌或杀菌活性，指导临床用药[12-13]。但目前关于DCS 与一线药物联合效应的报道尚不多见。鉴于以上情况，本研究采用体外联合药敏实验，探讨DSC 与利福平（Rifampicin，RFP）和异烟肼（Isoniazid，INH）对耐药结核分枝杆菌的体外作用效果。希望借此为临床抗结核药物配伍方案提供更多可靠合理的选择。

1 材料与方法

1.1 菌株

结核分枝杆菌标准株（H37Rv，ATCC27294）和38株经菌种鉴定为结核分枝杆菌的临床分离株为本室保存菌株。

1.2 试剂和耗材

7H9 培养基（M0178）和OADC（M0678）营养添加剂购自美国BD 公司；利福平（R3501）和异烟肼（I3377）购自美国Sigma 公司；Alamar Blue（R7017）购自美国AbD Serotec 公司；96 孔酶标板（M9410）购自美国Corning 公司。

1.3 药物最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）测定

采用微孔板Alamar blue 显色法测定菌株对DCS、利福平和异烟肼的MIC[14]。具体步骤参照文献[14]。96 孔板中每孔加入100 μl 7H9 培养基，采用倍比稀释的方法得到药物浓度梯度，同一行的各孔加入稀释菌液100 μl；另做一块空白板。在37℃培养箱中培养，从第6 天开始，空白板中加入显色剂隔天观察变色情况。MIC 定义为蓝色完全没有发生改变的最小药物浓度。确定药物MIC 后，倍比稀释下进行联合药物试验[15]。读取结果并记录单用和联用MIC。

1.4 分级抑菌浓度指数（fractional inhibitory concentration index，FICI）计算与判读标准

FICI=MIC A 药联用/MIC A 药单用+MIC B 药联用/MIC B 药单用；FICI≤0.5 为协同作用，0.5＜FICI≤4.0为无相关作用，FICI＞4.0 为拮抗作用[16]。

1.5 统计学方法

采用SPSS 22.0 统计软件对药物MIC 以及FICI进行数据分析，采用R 语言ggplot2 包可视化单用与联用MIC 变化分布情况。

2 结果

2.1 药物单用与联用对耐药结核分枝杆菌MIC 比较

38 株菌株MIC 见表1，与单独用药比较，DCS 分别与RFP 和INH 联用后，78.9%和71.1%菌株MIC 降低。如表2 所示，DSC 与RFP 和INH 联用后MIC50和MIC90 均明显下降，DSC 与RFP 和INH 单用和联用后各菌株MIC 对比分布箱线图如图1 所示，与单独用药比较，联用MIC 呈明显下降态势。

图1 DCS 与RFP 和INH 单用及联用MIC 分布箱线图

表1 38 株菌株DCS 与RFP 和INH 单用及联用MIC（μg/ml）

表2 DCS 与RFP 和INH 单用及联用MIC50 和MIC90（μg/ml，n=38）

2.2 联合用药FICI 指数

38 株菌株联用FICI 分布见表3。两种药物联合试验均未检测到对分离菌株的拮抗作用。联合药敏协同作用和无相关作用结果见图2～3。

图2 联合药敏协同作用结果示意图（FICI=0.25+0.25=0.5）

表3 DCS 与RFP 和INH 联用FICI 分布[例（%），n=38]

3 讨论

图3 联合药敏无相关作用结果示意图（FICI=0.5+0.5=1）

当前，由于不规范、不合理用药等因素加剧了耐多药结核病的治疗。寻找安全、有效的治疗药物是目前结核病研究的重要问题。联合用药能有效提高疗效、降低药物毒性和延缓耐药性的产生，近几年，采用联合用药治疗耐多药结核病已经成为一种重要的治疗方案[17-18]。DCS 可有效破坏细菌细胞壁，干扰结核分枝杆菌合成，提高抗结核效果，有研究表明，该药物临床耐药率较低，且与常规抗结核药物联合使用无交叉耐药性，对结核耐药菌株抗菌活性高[19-20]。Alamar blue显色法可用于结核分枝杆菌RFP 和INH 耐药性的快速检测[21]，棋盘稀释法是联合药敏的经典方法[22]。有研究显示，采用棋盘稀释法可准确评价以FICI 为基础的体外药物相互作用效果[23]。在体内外，抗菌药物联合效应包括协同、无关和拮抗。联合药敏实验评估DCS 与RFP 和INH 抗结核的作用效果，为临床结核病的治疗管理提供实验室理论依据。有研究发现，使用棋盘稀释法评估胡椒碱和RFP、INH、乙胺丁醇、链霉素中任一种联合使用的抗结核活性，是否具有协同性取决于联合的药物及研究的菌株，任何一组联合药物都不会对所有的结核菌株都表现为协同作用[24]，本研究也支持这一结果。本研究中DCS 与RFP 和INH 药物配伍时虽然协同效应分别仅为18.4%和13.2%。但是值得注意的是24 株（63.2%）菌株的RFP 联合MIC以及22 株（57.9%）菌株的INH 联合MIC 降低数个浓度梯度，两种联合药物方案均没有发现拮抗效应，与单独用药比较，联用MIC 呈明显下降态势，且联合用药后联用MIC50 和MIC90 均下 降。DCS 与RFP 和INH 联用均能不同程度地降低临床耐药株的耐药性，从侧面可推断针对耐药结核患者，采用DCS 联合方案能在保证有效药物浓度的前提下降低RFP 和INH的用药浓度，进而降低药物副作用。

综上所述，DCS 与RFP 和INH 联用，为耐多药结核病的治疗提供有益的实验依据，可能成为未来研究抗结核分枝杆菌药物相互作用的新选择。然而体外试验预测体内治疗效果有其局限性[25]，因此更确切的实际联合作用效果还需更进一步的临床验证。